編者按

 近年來，肌肉萎縮癥的關注度逐漸增加。在肌肉萎縮癥中，肌肉營養障礙、肌肉纖維變細甚至消失等導致的肌肉體積縮小，造成嚴重的痛苦和過早死亡，其早期診斷和治療至關重要。目前，對肌肉營養不良的固有抵抗力背后的機制仍然未知。

2024年3月2日，Umeå大學的一項關于肌肉萎縮癥的一篇題為“fhl2b mediates extraocular muscle protection in zebrafish models of muscular dystrophies and its ectopic expression ameliorates affected body muscles”的研究論文發表在nature communications期刊上，該研究通過轉錄組分析證明了斑馬魚EOMs和軀干肌肉對肌肉營養不良反應的基因表達的重要差異，同時證明了Fhl2是一種保護因子，是治療肌營養不良癥的候選靶基因。

文章題目

fhl2b mediates extraocular muscle protection in zebrafish models of muscular dystrophies and its ectopic expression ameliorates affected body muscles

雜志：《Nature Communications》（IF=16.6）

發表時間：2024.3.2

作者：Nils Dennhag, Abraha Kahsay等

單位：Umeå大學等

研究成果01

由40多種基因突變引起的肌肉萎縮癥具有相似的特征，包括導致肌肉無力的肌纖維斷裂、行動能力喪失以及主要由呼吸衰竭引起的過早死亡。肌營養不良最常見的形式是杜氏肌營養不良(DMD)。肌肉萎縮癥影響全球新生兒，引起明顯痛苦，但目前治療方案很少，無治愈方法。因此，需要新的有效治療方案，延長和改善患有此疾病患者的生活質量。

在這項研究中，研究人員使用了轉基因斑馬魚來研究肌肉萎縮癥如何影響眼部肌肉，通過使用獲得諾貝爾獎的CRISPR/Cas9基因編輯技術，在斑馬魚身上創建了新的遺傳疾病模型。通過轉錄組學分析證明了基因表達的重要差異，作為斑馬魚EOM和軀干肌肉之間肌肉萎縮的反應。研究人員發現LIM蛋白Fhl2響應于結蛋白、凝集素和隱蔽蛋白的敲除而增加，這些細胞骨架蛋白的敲除會導致不同的肌肉營養不良，并有助于EOM的疾病保護。此外，還發現fhl2的異位表達可以部分挽救斑馬魚杜氏肌營養不良癥模型sapje的肌肉表型，顯著提高其存活率。因此，Fhl2 是一種保護劑，也是治療肌營養不良癥的候選靶基因。

研究成果02

1. 斑馬魚的去纖維病模型顯示骨骼肌缺陷

為了研究非致命性肌營養不良癥背景下的眼外肌（EOMs），研究人員構建了desma+/-;desmb+/-斑馬魚，其兩個基因的外顯子1中均有提前終止密碼子。

這些突變導致截短的結蛋白缺乏α螺旋桿結構域，而螺旋桿結構域對于螺旋形成和三級結構形成至關重要。我們確認了 desma −/− ;Desmb −/− 雙突變體，與Desma +/- 不同;Desmb+/- 對照組在3 dPF時缺乏Desmin免疫標記（圖S1c）。幼蟲在第4天和第5天之間在1%甲基纖維素中飼養，以產生游泳阻力。這引發了顯著的肌纖維分離和斷裂，兩者都在 desma −/− 中;desmb −/− 突變體和desma −/− 單突變體，在 10–12th體節水平（圖1a，b），而desmb −/− 和desma +/- ;desmb 沒有 +/- 顯示肌纖維損傷（圖 1b），表明 desma 是肌肉拉伸強度的主要貢獻者。

圖1 desmin的缺乏導致肌纖維損傷和主干肌纖維的代謝轉移

2. 斑馬魚結節病模型保留了眼外肌的完整性

去絲病患者通常在30多歲之前沒有癥狀。為了評估缺乏結蛋白是否對肌纖維身份有影響，使用針對快速肌球蛋白輕鏈（F310）和針對慢肌球蛋白重鏈1、2 和 3 （S58）的抗體對24個月齡斑馬魚的軀干和 EOM 進行免疫標記。斑馬魚的軀干由肌纖維組成，這些肌纖維被結締組織薄層隔開，肌隔很容易在橫截面上識別（圖1，g，i，k，m中的虛線）。成年斑馬魚EOM也顯示出慢速和快速肌纖維的不同位置，盡管沒有被肌隔隔開（圖1o，q）。desma −/− 軀干肌肉的橫截面 ;與野生型 （WT） 對照相比，desmb −/− 突變體顯示慢結構域內快 F310 陽性肌纖維減少（圖 1g，h，開放箭頭），慢肌纖維直徑減小，慢結構域肌纖維數量顯著增加（desma +/+ ;desmb +/+ ） （圖 1I， j）。

結果表明，Desmin有助于肌纖維的完整性，并且是維持胚胎斑馬魚軀干中肌肉組織的正常功能所必需的，模型中保留了眼外肌的完整性。盡管缺乏Desmin，眼外肌的肌纖維成分仍保持不變，而軀干肌肉受到顯著影響并顯示出明顯的肌營養不良跡象。

3. fhl2b 的肌肉特異性過表達顯著提高了杜氏肌營養不良斑馬魚模型的存活率和肌纖維完整性

研究人員進一步地對其轉錄組分析，Fhl2b上調是眼外肌對肌營養不良癥的反應，并且隨著疾病進展而在突變斑馬眼外肌中增加。

由于Fhl2是缺乏desmin的EOMs轉錄組數據中唯一平行差異表達，在此研究Fhl2b是否也可以在肌肉萎縮癥中保護EOMs以外的肌肉，使用了斑馬魚杜氏肌營養不良模型sapje的肌肉表型稱為dmd - / -。數據顯示，異位表達Fhl2b可以部分挽救斑馬魚杜氏肌營養不良模型sapje的肌肉表型，顯著提高其存活率。因此，Fhl2是一種保護因子，是治療肌營養不良癥的候選靶基因。

圖2 肌肉特異性過表達fhl2b可顯著延長dmd - / -斑馬魚幼魚的壽命，改善運動功能和肌肉完整性

4. 肌肉特異性 fhl2b過表達可改善DMD −/− 幼蟲的運動軸突完整性和神經肌肉接頭

為了進一步了解fhl2b的過表達如何改善dmd −/− 表型，我們進行了轉錄組分析和RNA測序，并鑒定出DMD −/− 幼蟲特有的1054個DEGs（圖3a，基因集C）。這1054 個 DEG 對應于 dmd 疾病相關基因，其表達部分被 fhl2b 過表達挽救（圖 3b）。對所有交叉點的基因本體分析（圖3c，圖S7a，b）揭示了DMD −/− 幼蟲中軸突和神經元引導相關術語的獨特富集（圖3c），其中特別包括幾個信號素基因，對軸突引導和運動神經元存活至關重要（圖3d）。

此外，mir-206（一種調節性microRNA）和組蛋白脫乙酰酶4（hdac4）在杜氏肌營養不良癥患者中均上調，并被建議作為生物標志物 。我們測定了這些基因在系統中的表達，并觀察到它們在dmd −/− 幼蟲中顯著上調（圖3e，f）。然而，在 dmd −/− 中;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲，兩個基因的表達水平明顯接近同胞對照，相對而言可能表明組織更健康（圖3e，f）。測試DMD −/− 患者的軸突和神經肌肉接頭（NMJ）完整性是否得到改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲，我們使用乙?；⒐艿鞍卓贵w和α-bungarotoxin對5 dpf幼蟲進行免疫標記，分別標記軸突和突觸后NMJ（圖3g-i，圖S8）。

與同胞對照組相比，DMD −/− 幼蟲表現出細軸突，分支減少（圖3g，i，箭頭），此外，NMJ雜亂無章且支離破碎（圖5h，i箭頭），軸突和NMJ之間幾乎完全失去接觸。相比之下，dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲在正常軸突分支（圖3g）和NMJ組織（圖3i，開箭頭）附近顯示。由于 dmd −/− NMJ 非常碎片化，我們將健康的 NMJ 定義為 α-bungarotoxin 陽性點，大于最小的 WT 點。健康的NMJs在dmd −/− 中顯著降低，但在dmd −/− 中沒有顯著降低;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲（圖3k）。此外，與 dmd −/− 相比，dmd −/− 中的雙陽性突觸囊泡 2 （SV2）/α-bungarotoxin NMJ 顯著減少;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）和同胞對照幼蟲（圖3j箭頭，圖3l），表明肌纖維的神經支配減少。

為了量化軸突的完整性，我們使用乙?；⒐艿鞍酌庖邩擞浻紫x的 3D 渲染測量了軸突的長度（圖3m，o）和體積（圖3n，p），發現 dmd −/− 顯著改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）與DMD −/− 幼蟲相比。

總之，數據表明軸突回縮或降解是DMD −/− 幼蟲中常見的現象；在通過fhl2b表達挽救的肌纖維中，軸突、NMJ、神經支配和功能顯著改善，如游泳能力所證明的那樣，這可能是改善肌肉組織完整性的結果。

圖3 肌肉特異性過表達fhl2b改善dmd - / -斑馬魚幼魚軸突和神經肌肉連接處的完整性

5. fhl2b的肌肉特異性過表達加速巨噬細胞活性和肌肉再生

研究人員鑒定了 78個基因在 dmd −/− 疾病背景中響應 fhl2b 過表達而差異表達，發現了參與肌肉再生的基因，表明這是改善DMD −/− 肌肉完整性的可能機制;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲，并證實了 dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）肌纖維被fhl2b過表達部分挽救，以及dmd −/− ;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）肌纖維不易脫落。

通過延時研究觀察肌肉再生發現，dmd −/− 有顯著改善;Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）隨時間推移與dmd −/− 相比;Tg（503unc：EGFP）對照（圖4d，e）。總的來說，這些結果表明fhl2b過表達加速了肌肉再生。

進一步研究表明，Tg（503unc：fhl2b-T2A-EGFP）幼蟲通過增強巨噬細胞募集具有更快的肌纖維再生。

圖4. hl2b過表達導致dmd−/−斑馬魚幼魚再生標記上調

編者點評

本篇研究表明，Fhl2在幾種疾病模型的EOMs中上調，表明Fhl2是肌營養不良癥未來治療策略發展的有力候選。此外，研究中發現fhl2b的誘導表達可以提供對肌肉萎縮癥的抗性，并且EOMs提供了一種關于保護細胞策略的新方法，基于Fhl2的治療有可能用于緩解身體肌肉組織中的肌肉萎縮癥。

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