一、實驗材料
1. DNA樣本：大腸桿菌菌落、大腸桿菌菌液、農桿菌菌落、酵母菌落、小鼠基因組DNA、玉米基因組DNA、水稻基因組DNA。
2.快速PCR試劑：N132001，2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye)
3. 其他試劑：RNase-free H2O或DEPC處理水、相關基因上下游引物(儲存濃度10 μM)。
4. 設備與耗材：移液器、PCR儀、冰盒、離心機、EP管、RNase-free離心管。
二、實驗步驟
1. 試劑&樣本前期準備
1）試劑解凍和混勻：
冰箱取出：從-20℃冰箱中取出含酶試劑，立即放入冰盒中（冰上操作）。避免將試劑直接放在室溫下解凍，以免溫度波動影響酶的活性。
緩慢解凍：讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘。如果需要快速解凍，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱。
低速離心：PCR Mix在1×預混液中含有2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs，使用前要充分解凍混勻。將試劑管短暫離心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管蓋上的液體集中到管底。離心后置于渦旋儀震蕩10 sec混勻，確保試劑均勻分布?；靹蚝蟮脑噭^續放在冰上，避免長時間暴露在室溫下。如溶解后，暫未使用，可暫時儲存于4度放置。
Tips：混勻時盡量避免產生氣泡，氣泡可能會影響酶的活性或實驗結果的準確性。
2）模板稀釋（若需要）
以下是針對不同模板，PCR反應時推薦的使用量，用無菌超純水稀釋DNA或者線性化載體至目標濃度。Tips：模板DNA在儲存的過程中會有一定程度的降解，儲存前測試的濃度不一定準確，為了保證實驗精度，在放置一段時間后，需重新測試DNA模板濃度。
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模板種類 |
使用量范圍（25 μL反應體系） |
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基因組DNA |
10–1,000 ng |
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質?；?lambda;DNA |
0.5-50 ng |
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大腸桿菌菌液 |
0.5-0.8 OD600（2-4 μL） |
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大腸桿菌、農桿菌菌落 |
挑菌 |
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酵母菌菌落 |
挑菌到50 μL水中煮沸，冷凍，再溶解后取1-2 μL上樣 |
3）上機擴增，對比不同品牌擴增不同模板的性能
表 不同模板取樣原則
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模板 |
取樣原則 |
備注 |
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以大腸桿菌菌落、農桿菌菌落為模板 |
盡量使用新鮮長滿的平板
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大腸桿菌、農桿菌平板4度存放不得超過45天 |
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以大腸桿菌菌液為模板 |
使用新鮮搖菌的大腸桿菌菌液。挑取單菌落至1 mL液體培養基中，37℃搖床180 rpm培養3-4 h，至菌液渾濁但偏澄清的狀態，使用分光光度計測試OD600下的菌液濃度，OD600=0.5-0.6最佳。 |
OD600不宜超過1.2，菌液太濃會抑制擴增。 |
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以小鼠、玉米、水稻基因組DNA為模板 |
預計添加的樣本量為100 ng，將基因組DNA均稀釋為50 ng/μL |
根據Arcegen N132001說明書中基因組添加量進行樣本稀釋 |
表 PCR反應體系
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組分 |
體系 |
終濃度 |
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Arcegen，2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye)/V*/N*/P*/T* |
12.5 μL |
1× |
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上游引物F |
1 μL |
0.4-0.5 μM |
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下游引物R |
1 μL |
0.4-0.5 μM |
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大腸桿菌菌落/農桿菌菌落/大腸桿菌菌液/基因組DNA（50 ng/μL） |
挑菌/挑菌/2 μL/2 μL |
- |
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RNase-free H2O |
Up to 25 μL |
- |
【注意】配制完成后，用桌面離心機瞬離所有試劑到管底，然后渦旋10 sec振蕩混勻，若期間有氣泡，要將氣泡輕輕指彈震裂，離心10 sec后立即上機；若暫時不能上機，可于-20℃暫存1 h。
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表 Arcegen產品PCR反應程序 |
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溫度 |
時間 |
循環數 |
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95℃ |
3 min |
1 |
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95℃ |
15 sec |
35 |
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60℃ |
20 sec |
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72℃ |
1 sec/kb |
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72℃ |
5 min |
1 |
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4℃ |
∞ |
1 |
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表 P產品PCR反應程序-按P品牌說明書 |
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表 N產品PCR反應程序-按N品牌說明書 |
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溫度 |
時間 |
循環數 |
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溫度 |
時間 |
循環數 |
|
95℃ |
2 min |
1 |
95℃ |
30 sec |
1 |
|
|
95℃ |
30 sec |
35 |
95℃ |
15 sec |
30 |
|
|
60℃ |
15 sec |
60℃ |
15 sec |
|||
|
72℃ |
15 sec /kb |
68℃ |
1 min/kb |
|||
|
72℃ |
5 min |
1 |
68℃ |
5 min |
1 |
|
|
4℃ |
∞ |
1 |
4℃ |
∞ |
1 |
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表 V產品PCR反應程序-按V品牌說明書 |
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表 T產品PCR反應程序-按T品牌說明書 |
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|
溫度 |
時間 |
循環數 |
|
溫度 |
時間 |
循環數 |
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95℃ |
3 min |
1 |
95℃ |
3 min |
1 |
|
|
95℃ |
15 sec |
35 |
95℃ |
30 sec |
35 |
|
|
60℃ |
15 sec |
60℃ |
30 sec |
|||
|
72℃ |
15 sec/kb |
72℃ |
1 min/kb |
|||
|
72℃ |
5 min |
1 |
72℃ |
5 min |
1 |
|
|
4℃ |
∞ |
1 |
4℃ |
∞ |
1 |
|
【注意】
A.推薦退火溫度：60°C，也可根據自身需要設立溫度梯度摸索引物退火的最適溫度。推薦退火時間設置為20 sec，可以在10-30 sec內調節。但需注意退火時間過長可能導致擴增產物在膠上呈彌散狀。
B.延伸速度設置可參考下表：本次擴增目的片段均為1 kb左右，因此設置為1 sec/kb。
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模板類型 |
片段大小 |
擴增速度 |
備注 |
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簡單模板（質粒、λDNA等） |
≤6 kb |
1 sec/kb |
如需提高產量可適當延長延伸時間，不宜超過30 sec/kb。 |
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6-10 kb |
3 sec/kb |
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＞10 kb |
5-10 sec/kb |
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復雜模板（基因組、大腸桿菌等） |
≤3 kb |
1 sec/kb |
|
|
3-6 kb |
3 sec/kb |
||
|
6-10 kb |
5-10 sec/kb |
||
|
＞10 kb |
10 sec/kb |
C.循環數可設置為30-35個循環。無需再增加循環數。因為過多的循環雖然能增加產物量，但會導致非特異性產物擴增和假陽性的風險。
4）產物電泳
配制1%瓊脂糖凝膠插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反應液上樣（Arcegen PCR試劑已含有紅色示蹤染料，無需添加loading buffer，可直接上樣）。
A、Arcegen產品擴增不同模板表現優于市面上其他競品，擴增速度快，檢出率高，擴增產量高。
注：1：大腸桿菌菌落；2：大腸桿菌菌液；3：小鼠基因組DNA；4：玉米基因組DNA；5：水稻基因組DNA；6：農桿菌菌落。
B、Arcegen產品擴增酵母表現優于市面上其他競品，擴增速度快，檢出率高，擴增產量高。
產品訂購
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產品應用 |
產品名稱 |
產品貨號 |
產品規格 |
目錄價 |
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廣泛物種及樣本快速PCR，菌落及菌液PCR，陽性克隆快速鑒定 |
N132001E |
1 mL |
60.00 |
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N132001S |
5×1 mL |
250.00 |
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N132001M |
50×1 mL |
2000.00 |
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N132001L |
100×1mL |
3500.00 |
相關產品
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應用類型 |
產品名稱 |
貨號 |
規格 |
目錄價 |
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50℃快至5分鐘完成重組反應，陽性率可達95%以上 |
N132081S |
20 T |
500.00 |
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N132081M |
50 T |
1100.00 |
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凝膠電泳必備款 |
N132101S |
100 g |
180.00 |
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N132101M |
500 g |
810.00 |
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無需稱量，一次一片，不用擔心瓊脂糖掛壁 |
N132103S |
1 BOX (200 TABLETS) |
1200.00 |
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替代EB的無毒染料，適用藍光及紫外光 |
N132109S |
500 μL |
580.00 |
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N132116S |
100 T |
110.00 |
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N132116M |
10×100 T |
990.00 |
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N132111S |
100 T |
110.00 |
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N1321112M |
10×100 T |
990.00 |
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N132112S |
100 T |
110.00 |
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N132112M |
10× 100 T |
990.00 |
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N132113S |
100 T |
110.00 |
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N132113M |
10×100 T |
990.00 |
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N132114S |
100 T |
110.00 |
||
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N132114M |
10×100 T |
990.00 |
||
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N132115S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132115M |
10×100 T |
990.00 |
||
|
N132117S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132117M |
10× 100 T |
990.00 |
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|
N132118S |
100 T |
110.00 |
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N132118M |
10× 100 T |
990.00 |
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|
N132119S |
100 T |
110.00 |
||
|
N132119M |
10×100 T |
990.00 |
||
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N132120S |
1 mL |
110.00 |
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|
N132120M |
100x1 mL |
20900.00 |
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N132121S |
100 T |
110.00 |
||
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N132121M |
10× 100 T |
990.00 |