實驗材料

cDNA樣本：通過上游反轉錄反應得到的cDNA。

熒光定量試劑：Cat#N132034，可示蹤qPCR染料法預混液（No/Low/High Rox）

其他試劑：RNase-free H₂O、相關基因上下游引物(儲存濃度10 μM)。

設備與耗材：移液器、qPCR儀、冰盒、離心機、RNase-free八連排、RNase-free離心管。

實驗步驟

1.試劑&樣本前期準備

試劑解凍和混勻：

1）從冰箱中取出：

從-20℃冰箱中取出含酶試劑，立即放入冰盒中（冰上操作）。【注意】避免將試劑直接放在室溫下解凍，以免溫度波動影響酶的活性。

2）緩慢解凍：

讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘。如果需要快速解凍，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱。

3）輕輕顛倒混勻：

解凍后，將試劑管輕輕上下顛倒幾次，使試劑充分混勻。【注意】避免劇烈震蕩或渦旋混勻，以免破壞酶的活性。

4）低速離心：

將試劑管短暫離心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管蓋上的液體集中到管底。離心后再次輕輕混勻，確保試劑均勻分布?；靹蚝蟮脑噭^續放在冰上，避免長時間暴露在室溫下。

【注意】混勻時盡量避免產生氣泡，氣泡可能會影響酶的活性或實驗結果的準確性。

2.模板稀釋(若需要)

稀釋步驟：

1）若需追蹤模板，按以下步驟稀釋：取1 μL 10×Dilution Buffer + 9 μL無菌超純水 → 配制1×Dilution Buffer。用1×Dilution Buffer稀釋cDNA至目標濃度（建議稀釋至Ct值20-30的范圍內）。

2）若無需追蹤模板，直接用無菌超純水稀釋cDNA或者直接使用cDNA原液。

3.熒光定量PCR反應體系配置

常見的熒光定量儀器為96孔反應，大體分為12列×8行。舉例說明：

【注意】：

a. 相對定量分析基因表達情況時，為排除樣本和操作的影響，對數據進行歸一化，需要有內參基因，例如GAPDH、β-actin等等。

b. 技術重復通常建議設置3孔，為保證后續取平均值或剔除異常值。當然根據自己的需求進行調整，設置2孔重復或者4孔重復均可。

c. 依據MIQE準則，NTC(陰性對照)建議設置，一方面用于污染風險判斷，另一方面其也是一套實時熒光定量 PCR (qPCR) 實驗設計及數據報告實踐指南以及與發文共享實驗信息的標準。

1）熒光定量PCR大體系配制

以上述投入2μL cDNA模板檢測不同樣本基因1為例：

將上述溶液依次加好后，將管蓋蓋嚴，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻，再放入小型離心機，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上。

【注意】如使用顯蹤劑建議模板投入體積控制在2-5 μL，以保證顯蹤效果，如使用cDNA母液建議投入體積控制在2 μL(反應體系的1/10)以內防止影響擴增效果。

2）上樣體系配置

按照上機儀器選取對應耗材（八聯排或96孔板）。

在對應耗材中按照布板依次分裝18μL/孔步驟1)配置的大體系Mix。

在每個孔中加入2 μL對應模板。

4. 熒光定量PCR上機運行

上機前，仔細檢查管子，確保正上方管蓋、管身沒有記號筆染料，管內無氣泡、管壁無液體。

若采用常規程序，則進行以下設置：

【注意】不同熒光定量qPCR試劑核心的酶和Buffer組成都存在差異，對應說明書上的程序是該產品大多數情況下的最適反應條件，建議按照說明書的程序進行儀器設置，減少因用其他程序帶來的數據偏差。熔解曲線程序可選用儀器默認程序。以ABI Q5常規程序為例，在進行程序設置時，確保在退火/延伸階段和熔解曲線的升溫階段打開數據信號收集開關。

若采用快速程序，需確認儀器本身是否可以快速升降溫，運行快速程序。以下以ABI Q5為例：

5. 結果判定

觀察熔解曲線峰是否單一。

初步判斷復孔間Ct值差距是否＜0.5，或者進一步計算復孔間CT值STD是否＜0.2。

內參基因Ct值盡量在14-25之內，不要過小也不要過大。

6. 數據分析

【注意】不要隨意對下機數據進行取舍，實際計算時不可忽略小數點后的所有數字。

7. 不同類型儀器配套熒光定量試劑指南

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