2024年5月，中國香料香精化妝品工業協會于江蘇無錫國際會議中心，舉辦了2024中國化妝品科學技術大會暨第十五屆學術研討會。會議圍繞“新質美麗，恒久綻放”為主題，專家院士、企業代表等匯聚一堂，共探化妝品產業前沿技術創新。
會議期間，由環特生物所作論文《離體皮膚模型及其在化妝品功效評價中的應用》成功入選大會會議期刊優秀論文精選，不僅是環特多維生物技術平臺可視化學術證據鏈新的落腳點，更是對離體皮膚（皮膚外植體）科學和化妝品產業有機融合的進一步的探究和突破。
離體皮膚模型又被稱為皮膚外植體模型，作為一項皮膚科學的新興技術，現如今正在扮演著愈發重要的角色。如何將離體皮膚（皮膚外植體）模型深度應用到化妝品功效評價之中，未來離體皮膚（皮膚外植體）技術的發展又能為我們創造出哪些全新的可能，且看下文一一為您闡述。
題目：離體皮膚模型及其在化妝品功效評價中的應用
會議：2024中國化妝品科學技術大會暨第十五屆學術研討會
時間：2024年5月
作者：龍洋、周示玉、沈佳琪
單位：杭州環特生物科技股份有限公司
01、研究背景
1959年，英國科學家RUSSELL和BURCH最先提出了3R理念，即減少（減少實驗動物使用數量和實驗次數）、優化（對必須使用的實驗動物、優化動物實驗流程和動物福利）、代替（低級動物替代高級動物、使用無知覺實驗材料替代）的概念，并在當年出版的《人道實驗技術原理》一書中發表了這一概念。2013年，歐盟全面禁止開展化妝品的動物實驗，并禁止銷售任何在動物身上進行安全測試的化妝品，包括化妝品原材料。隨著3R理念的不斷發展和歐盟動物實驗禁令的頒布，化妝品及其原材料功效評價的體外替代模型及方法得以飛速發展。
離體皮膚也被稱為皮膚外植體，它是由人體來源的皮膚組織經體外培養而獲得的模型。離體皮膚通過適當的培養方式，可在體外維持一定的組織活力，目前，已被廣泛應用于化妝品功效測評、傷口愈合、皮膚相關疾病的研究中。離體皮膚是最接近健康和患病皮膚生理機能的模型，包含完整的皮膚細胞類群如角質形成細胞、成纖維細胞、黑素細胞、朗格漢斯細胞；含有膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖等細胞外基質；包含皮膚附屬物如毛囊、汗腺等。
02、離體皮膚模型概述
離體皮膚的來源與體外培養
離體皮膚主要來源于臨床捐獻的或廢棄的皮膚組織，它包含天然的皮膚結構，即包含完整的表皮層、真皮層、皮下組織、皮膚附屬物。通過體外培養的方法，能夠最真實地模擬人體皮膚在正常生理環境下的狀態與功能。
常見的離體皮膚可來源于腹部、胸部、背部、面部、頭皮、包皮等。選擇性腹部、胸部、背部整形手術獲得的離體皮膚，由于其很少暴露于外部因素（例如太陽輻射、空氣污染等）中，所以保留皮膚組織最基礎的特性，常被用來進行皮膚光老化、皮膚衰老、皮膚屏障等研究。頭皮來源的離體皮膚由于包含完整毛囊結構，是研究頭發生長、毛囊老化、防脫發的寶貴模型。
離體皮膚從臨床上切除后，應盡快收集在含有0.9%氯化鈉的溶液中，并放于4℃短期保存（4℃下可保存3小時）。使用離體皮膚作為研究模型的基本標準是保證樣品厚度和尺寸的一致性，因此，可通過電動皮片機或手動皮膚取樣器，將皮膚組織分割成相同大小的圓形皮片。制備好的皮片按照表皮層朝上真皮層朝下放置于含有慶大霉素和兩性霉素B的DMEM高糖培養基中進行氣液培養，或使用細胞培養插入模具以保持皮膚組織處于氣液培養的環境，之后，將皮膚組織放置在37℃，含有5% CO2的培養箱內進行培養。
離體皮膚模型的應用與局限
離體皮膚由于其具有天然而復雜的皮膚結構，包括表皮層、真皮層、皮下組織、皮膚附屬物、基底膜、細胞外基質等，而具備較為完整的皮膚功能，是最接近人體真實情況的模型，通過特定的培養方式，可在體外持續保持活力，因而被廣泛的應用于皮膚相關疾病的研究、傷口愈合和疤痕的研究、皮膚滲透性的研究以及外用產品的功效和安全性評估。
離體皮膚作為與人體最接近的皮膚模型，其新陳代謝能力較強，皮膚滲透性與人體一致，不僅能在分子水平上進行機制的探究還能在組織水平表征皮膚結構和功能的變化過程。盡管離體皮膚作為動物試驗的替代模型，已被廣泛應用于皮膚相關疾病和外用產品的安全性和功效性研究，但仍具有較多的局限性，具體可總結為以下幾點：
1）有限的來源。由于離體皮膚來源于手術廢棄或捐獻的人體皮膚組織，故而來源有限，無法大量獲取，且無法像斑馬魚和細胞模型一樣實現實驗室或產業化大規模、高通量篩選。
2）法律法規和倫理道德的限制。用于科學研究的離體皮膚由于其來源特殊需經過醫院或有關部門的倫理審查、獲取患者的知情同意、且遵循 《赫爾辛基宣言》后才能使用。此外，相關法律法規的逐步完善可能對離體皮膚的獲取與應用產生限制。
3）個體與皮膚部位的差異。來源于不同部位的離體皮膚可能需要不同的保存和培養條件；離體皮膚的部位、年齡或個體差異可能導致皮膚活力的不同，由此可造成模型不穩定、實驗結果重復性和一致性較差。
4）體外保存和培養。離體皮膚保存、運輸、培養的條件苛刻、成本較高，長時間的培養和操作過程將導致皮膚組織活力的下降和組織損傷。
5）生物安全性。離體皮膚來源于人體且存在生物活性，其對于研究人員存在一定的生物暴露的風險，在使用離體皮膚進行研究時，應充分考慮生物安全等問題。
03、離體皮膚模型在化妝品功效評價中的應用
抗衰老功效
衰老是生物進程中自然發生的過程，皮膚形態和生理的衰退是衰老的第一征兆，也是最明顯的臨床特征。人類皮膚衰老分為內源性衰老和外源性衰老，逆轉皮膚衰老或減緩皮膚衰老逐漸成為化妝品領域最為關注的焦點之一。皺紋是皮膚衰老最直觀的表型，皺紋的形成與自然老化、光老化等密切相關，細胞外基質中膠原蛋白、彈性蛋白的減少是皮膚衰老和皺紋產生的主要原因。
圖：原纖維蛋白1、彈性蛋白、纖連蛋白免疫熒光染色典型圖
目前，已有許多研究證實離體皮膚是評價化妝品抗衰老功效的有效模型。ASSERIN等人利用離體皮膚的體外實驗證實，膠原蛋白肽可誘導皮膚組織中膠原蛋白和糖胺聚糖的產生，由此可改善皮膚老化的標志。GREF等人發現適用于乳霜配方的維生素C-角鯊烯偶聯物作用于離體皮膚之后，可顯著增加表皮厚度，并促進膠原蛋白Ⅲ和糖胺聚糖的產生。將離體培養的皮膚外植體局部暴露于銅離子緩沖液中，不影響離體皮膚的活力或組織形態，且能夠促進彈性蛋白、前膠原蛋白Ⅰ和TGF-β1的分泌，起到抵抗皮膚衰老的作用。茶堿通過降低MMP-2和MMP-9的表達、增加褪黑激素水平，維持細胞外基質的穩定性，拮抗ROS供體甲苯醌的刺激作用，從而起到抗衰老、抗氧化的作用。此外，離體皮膚還可以被用來進行化妝品配方篩選，例如，藍銅肽和透明質酸是常見的兩種護膚成分，將兩者組合對Ⅳ型膠原蛋白的生成具有協同作用，研究人員發現二者在1:9的比例下可將膠原蛋白Ⅳ的合成提高2.03倍。
屏障修護功效
圖：FLG免疫熒光染色典型圖
皮膚作為人體最大的器官在保護人體免受有害物質的入侵中發揮著重要的作用，其中皮膚屏障在其中起關鍵作用。皮膚屏障是由角質層、角質細胞間脂類及天然保護因子構成，90%的皮膚屏障功能依賴于角質層。角質層的形成涉及幾種重要的角蛋白中間絲相關蛋白的表達，包括絲聚合蛋白（Filaggrin）、兜甲蛋白（Loricrin）、內披蛋白（Involucrin）、小分子富含脯氨酸蛋白（SPRPS）等。
圖：LOR免疫熒光染色典型圖
研究人員發現，離體培養48小時的全層皮膚可保持屏障特性，且能對不同強度的屏障破壞做出反應，使用膠帶剝離或4小時十二烷基硫酸鈉（SLS）處理通過破壞皮膚結構、促進炎癥因子IL-6、IL-8的表達破壞皮膚屏障。使用1:1（v:v）乙醚：丙酮混合物對離體皮膚進行損傷造模，PPAR-α激動劑RFV3可通過增加神經酰胺、絲聚蛋白和轉谷氨酰胺酶1的表達來促進離體皮膚的屏障修護過程。離體皮膚模型還被用來評估清潔產品的功效，ZHOU等人通過對沐浴露A和沐浴露B處理的離體皮膚進行免疫熒光染色發現，與水對照和沐浴露A處理相比，經沐浴露B處理的離體皮膚在處理7天后，顆粒層和角質層中絲聚蛋白的表達顯著減少，證明沐浴露B對皮膚屏障具有破壞作用，此外，使用MTT檢測離體皮膚的組織活力也是用來評價皮膚屏障修護功效的重要指標。
抗糖化功效
糖化反應，又稱美拉德反應，其晚期糖基化產物也被稱為AGEs，AGEs隨著年齡不斷累積，一方面會通過改變真皮ECM的功能使細胞形態改變，另一方面會通過激活下游信號通路，影響細胞、組織功能，促進皮膚衰老。具有抗糖基化活性的天然化合物可能具有較大的抗衰老潛力。糖基化誘導劑甲基乙二醛（MGO）可誘導糖基化產物的產生，在MGO造模的情況下，SHIN等人利用離體皮膚研究了沒食子酸甲酯的抗糖化作用，沒食子酸甲酯通過降低羧甲基賴氨酸（CML）的表達、刺激纖維蛋白I的表達來發揮其抗糖化作用。另一項在離體皮膚中的研究表明，氨基胍、葛根素、綠原酸可促進纖維蛋白I的產生和抑制CML的產生，這表明這些活性成分具備抗氧化和抗糖化的功效。此外，與MGO處理相比，水飛薊花提取物水飛薊賓涂抹8天，可顯著降低皮膚外植體中CML的表達。
保濕功效
充足的水分是皮膚保持健康和正常功能的基礎，皮膚保持水分的能力主要與角質層有關，角質層起到防止水分流失的作用，這一作用主要與天然保濕因子和角質層細胞間脂質有序排列形成的跨表皮失水屏障有關。水通道轉運蛋白3（AQP3）以及顆粒層和角質層交界處緊密連接結構在皮膚水分保持和屏障功能中發揮作用。透明質酸（HA）是一種內源性皮膚基質成分，具有保濕、抗炎等特性，對維持正常的角質層結構和表皮的屏障功能至關重要。含有透明質酸的化妝品配方可以增強皮膚結構、滋潤皮膚、減少皺紋。
圖：ELISA檢測透明質酸HA含量
已有多篇文獻報道了使用離體皮膚模型研究化妝品及其原材料的保濕功效，例如化妝品配方原料綠咖啡油（GCO）孵育離體皮膚，可顯著增加AQP3的表達，以此來改善皮膚生態，防止表皮干燥。全反式維甲酸（ATRA）的局部處理可顯著增加離體皮膚表皮基底層中AQP3的表達，增強其免疫反應性。使用不同濃度的視黃醇連續處理離體皮膚，使用生物素化抗透明質酸結合蛋白（HABP）抗體進行染色，發現穩定的視黃醇配方促進了離體皮膚中HA的產生，且視黃醇通過促進皮膚組織中HAS3基因的表達來增強皮膚的保濕作用。此外，另有一項研究使用離體皮膚和ELISA檢測方法，對比了高分量和低分子量的HA配方處理后HA在角質層中的擴散情況，并為人體臨床試驗提供了最佳建議。
透皮吸收
物質的透皮吸收是指其作用于皮膚表面后進入表皮或真皮，并在該部位聚集并發揮功效的過程?；瘖y品在皮膚中的滲透性是其發揮功效的重要前提，研究物質在皮膚中的滲透與分布，可為產品配方優化、功效評價等提供重要的數據支持，而離體皮膚是研究物質透皮吸收不可或缺的模型。
圖：環特生物離體皮膚拉曼光譜成像典型圖
將離體皮膚與Franz擴散法、高效液相色譜（HPLC）檢測技術結合，是目前普遍且應用廣泛的化妝品透皮吸收檢測技術。已有研究人員利用此方法探究輔酶Q10的卵磷脂微乳液和親水乳膏配方對皮膚滲透性的影響。二氫槲皮素是具有抗氧化活性的黃酮醇，通過離體皮膚的Franz擴散-HPLC檢測，發現二氫槲皮素水包油乳液的滲透性可達到48.09%每劑，且HPLC檢測具有精確性（CV<5%）、準確性（回收率在98%和102%之間）、線性（R2>0.99）。雖然HPLC對待測物質的滲透性有著精準地檢測，但此種方法無法實現對待測物質的滲透性進行可視化的分析，將離體皮膚、Franz擴散法與拉曼光譜技術相結合極大地彌補了這一缺口。拉曼光譜是一種振動光譜，是物質的一種固有屬性，已被廣泛應用于物質的成分鑒定、分子結構、譜線特征等研究。有文獻報道了使用拉曼光譜成像技術檢測水楊酸在皮膚中滲透行為，水楊酸的濃度分布以熱圖的形式展現，拉曼光譜成像結果與HPLC結果得到的目標濃度變化趨勢一致。KANG等人將拉曼光譜與多元線性回歸算法結合，通過計算待測物的濃度貢獻因子，將其分布情況可視化為熱圖，并采用次方法獲得了透明質酸和利多卡因在皮膚中的滲透圖像。這些實驗結果均表明離體皮膚模型和拉曼光譜技術在化妝品透皮吸收研究中的可靠性和可視化性。
04、結語與展望
不同于新興的3D重組皮膚模型、皮膚類器官和器官芯片模型，離體皮膚雖然擁有較為久遠的發展歷史，但由于其具有倫理限制、獲取困難、個體差異等特殊的局限性，在化妝品領域的應用并不廣泛。與傳統的細胞模型相比，離體皮膚不僅可以在分子細胞水平實現對待測物的評估，更能在組織水平評估待測物的功效，具有良好的可視化和宣傳效果。已有大量的研究表明，離體皮膚是研究經皮給藥、化妝品及原材料功效、藥品和化妝品安全性、刺激性和毒性的有效替代模型，也逐漸被國內外藥品和化妝品的原料商、出品方、監管機構和消費者所認可。離體皮膚在化妝品領域的應用或將彌補化妝品安全性和功效評價體系的缺口。然而，目前國內外仍缺乏離體皮膚用于化妝品功效評價的行業標準和監督管理規范，未來可通過起草離體皮膚評價方法的技術指南、制定離體皮膚用于化妝品功效評價的標準規范、完善化妝品安全監管的法律法規文件，進一步提高離體皮膚模型在行業內的認可度、擴大離體皮膚模型在化妝品領域的應用范圍。
隨著新原料的開發和化妝品技術的不斷發展，化妝品行業的市場競爭也日漸激烈，這些現狀對化妝品及其原材料的功效評價方法的開發和模型的建立提出了更多需求，也對用于化妝品功效宣稱的評價體系提出了更全面的要求。化妝品及其原材料種類繁多、作用機制復雜，單一的評價方法或使用單一的評價模型難以全面、科學、準確地評價其功效。因此，在進行化妝品功效評價或驗證的過程中，應采取多指標、多模型、多維度的檢測，形成綜合、高效、系統的評價體系。
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