2024年5月，中國(guó)香料香精化妝品工業(yè)協(xié)會(huì)于江蘇無錫國(guó)際會(huì)議中心，舉辦了2024中國(guó)化妝品科學(xué)技術(shù)大會(huì)暨第十五屆學(xué)術(shù)研討會(huì)。會(huì)議圍繞“新質(zhì)美麗，恒久綻放”為主題，專家院士、企業(yè)代表等匯聚一堂，共探化妝品產(chǎn)業(yè)前沿技術(shù)創(chuàng)新。
會(huì)議期間，由環(huán)特生物所作論文《離體皮膚模型及其在化妝品功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用》成功入選大會(huì)會(huì)議期刊優(yōu)秀論文精選，不僅是環(huán)特多維生物技術(shù)平臺(tái)可視化學(xué)術(shù)證據(jù)鏈新的落腳點(diǎn)，更是對(duì)離體皮膚（皮膚外植體）科學(xué)和化妝品產(chǎn)業(yè)有機(jī)融合的進(jìn)一步的探究和突破。
離體皮膚模型又被稱為皮膚外植體模型，作為一項(xiàng)皮膚科學(xué)的新興技術(shù)，現(xiàn)如今正在扮演著愈發(fā)重要的角色。如何將離體皮膚（皮膚外植體）模型深度應(yīng)用到化妝品功效評(píng)價(jià)之中，未來離體皮膚（皮膚外植體）技術(shù)的發(fā)展又能為我們創(chuàng)造出哪些全新的可能，且看下文一一為您闡述。
題目：離體皮膚模型及其在化妝品功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
會(huì)議：2024中國(guó)化妝品科學(xué)技術(shù)大會(huì)暨第十五屆學(xué)術(shù)研討會(huì)
時(shí)間：2024年5月
作者：龍洋、周示玉、沈佳琪
單位：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司
01、研究背景
1959年，英國(guó)科學(xué)家RUSSELL和BURCH最先提出了3R理念，即減少（減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用數(shù)量和實(shí)驗(yàn)次數(shù)）、優(yōu)化（對(duì)必須使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、優(yōu)化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程和動(dòng)物福利）、代替（低級(jí)動(dòng)物替代高級(jí)動(dòng)物、使用無知覺實(shí)驗(yàn)材料替代）的概念，并在當(dāng)年出版的《人道實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理》一書中發(fā)表了這一概念。2013年，歐盟全面禁止開展化妝品的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并禁止銷售任何在動(dòng)物身上進(jìn)行安全測(cè)試的化妝品，包括化妝品原材料。隨著3R理念的不斷發(fā)展和歐盟動(dòng)物實(shí)驗(yàn)禁令的頒布，化妝品及其原材料功效評(píng)價(jià)的體外替代模型及方法得以飛速發(fā)展。
離體皮膚也被稱為皮膚外植體，它是由人體來源的皮膚組織經(jīng)體外培養(yǎng)而獲得的模型。離體皮膚通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式，可在體外維持一定的組織活力，目前，已被廣泛應(yīng)用于化妝品功效測(cè)評(píng)、傷口愈合、皮膚相關(guān)疾病的研究中。離體皮膚是最接近健康和患病皮膚生理機(jī)能的模型，包含完整的皮膚細(xì)胞類群如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞；含有膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)；包含皮膚附屬物如毛囊、汗腺等。
02、離體皮膚模型概述
離體皮膚的來源與體外培養(yǎng)
離體皮膚主要來源于臨床捐獻(xiàn)的或廢棄的皮膚組織，它包含天然的皮膚結(jié)構(gòu)，即包含完整的表皮層、真皮層、皮下組織、皮膚附屬物。通過體外培養(yǎng)的方法，能夠最真實(shí)地模擬人體皮膚在正常生理環(huán)境下的狀態(tài)與功能。
常見的離體皮膚可來源于腹部、胸部、背部、面部、頭皮、包皮等。選擇性腹部、胸部、背部整形手術(shù)獲得的離體皮膚，由于其很少暴露于外部因素（例如太陽(yáng)輻射、空氣污染等）中，所以保留皮膚組織最基礎(chǔ)的特性，常被用來進(jìn)行皮膚光老化、皮膚衰老、皮膚屏障等研究。頭皮來源的離體皮膚由于包含完整毛囊結(jié)構(gòu)，是研究頭發(fā)生長(zhǎng)、毛囊老化、防脫發(fā)的寶貴模型。
離體皮膚從臨床上切除后，應(yīng)盡快收集在含有0.9%氯化鈉的溶液中，并放于4℃短期保存（4℃下可保存3小時(shí)）。使用離體皮膚作為研究模型的基本標(biāo)準(zhǔn)是保證樣品厚度和尺寸的一致性，因此，可通過電動(dòng)皮片機(jī)或手動(dòng)皮膚取樣器，將皮膚組織分割成相同大小的圓形皮片。制備好的皮片按照表皮層朝上真皮層朝下放置于含有慶大霉素和兩性霉素B的DMEM高糖培養(yǎng)基中進(jìn)行氣液培養(yǎng)，或使用細(xì)胞培養(yǎng)插入模具以保持皮膚組織處于氣液培養(yǎng)的環(huán)境，之后，將皮膚組織放置在37℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
離體皮膚模型的應(yīng)用與局限
離體皮膚由于其具有天然而復(fù)雜的皮膚結(jié)構(gòu)，包括表皮層、真皮層、皮下組織、皮膚附屬物、基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)等，而具備較為完整的皮膚功能，是最接近人體真實(shí)情況的模型，通過特定的培養(yǎng)方式，可在體外持續(xù)保持活力，因而被廣泛的應(yīng)用于皮膚相關(guān)疾病的研究、傷口愈合和疤痕的研究、皮膚滲透性的研究以及外用產(chǎn)品的功效和安全性評(píng)估。
離體皮膚作為與人體最接近的皮膚模型，其新陳代謝能力較強(qiáng)，皮膚滲透性與人體一致，不僅能在分子水平上進(jìn)行機(jī)制的探究還能在組織水平表征皮膚結(jié)構(gòu)和功能的變化過程。盡管離體皮膚作為動(dòng)物試驗(yàn)的替代模型，已被廣泛應(yīng)用于皮膚相關(guān)疾病和外用產(chǎn)品的安全性和功效性研究，但仍具有較多的局限性，具體可總結(jié)為以下幾點(diǎn)：
1）有限的來源。由于離體皮膚來源于手術(shù)廢棄或捐獻(xiàn)的人體皮膚組織，故而來源有限，無法大量獲取，且無法像斑馬魚和細(xì)胞模型一樣實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室或產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模、高通量篩選。
2）法律法規(guī)和倫理道德的限制。用于科學(xué)研究的離體皮膚由于其來源特殊需經(jīng)過醫(yī)院或有關(guān)部門的倫理審查、獲取患者的知情同意、且遵循 《赫爾辛基宣言》后才能使用。此外，相關(guān)法律法規(guī)的逐步完善可能對(duì)離體皮膚的獲取與應(yīng)用產(chǎn)生限制。
3）個(gè)體與皮膚部位的差異。來源于不同部位的離體皮膚可能需要不同的保存和培養(yǎng)條件；離體皮膚的部位、年齡或個(gè)體差異可能導(dǎo)致皮膚活力的不同，由此可造成模型不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和一致性較差。
4）體外保存和培養(yǎng)。離體皮膚保存、運(yùn)輸、培養(yǎng)的條件苛刻、成本較高，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和操作過程將導(dǎo)致皮膚組織活力的下降和組織損傷。
5）生物安全性。離體皮膚來源于人體且存在生物活性，其對(duì)于研究人員存在一定的生物暴露的風(fēng)險(xiǎn)，在使用離體皮膚進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)充分考慮生物安全等問題。
03、離體皮膚模型在化妝品功效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
抗衰老功效
衰老是生物進(jìn)程中自然發(fā)生的過程，皮膚形態(tài)和生理的衰退是衰老的第一征兆，也是最明顯的臨床特征。人類皮膚衰老分為內(nèi)源性衰老和外源性衰老，逆轉(zhuǎn)皮膚衰老或減緩皮膚衰老逐漸成為化妝品領(lǐng)域最為關(guān)注的焦點(diǎn)之一。皺紋是皮膚衰老最直觀的表型，皺紋的形成與自然老化、光老化等密切相關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白、彈性蛋白的減少是皮膚衰老和皺紋產(chǎn)生的主要原因。
圖：原纖維蛋白1、彈性蛋白、纖連蛋白免疫熒光染色典型圖
目前，已有許多研究證實(shí)離體皮膚是評(píng)價(jià)化妝品抗衰老功效的有效模型。ASSERIN等人利用離體皮膚的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膠原蛋白肽可誘導(dǎo)皮膚組織中膠原蛋白和糖胺聚糖的產(chǎn)生，由此可改善皮膚老化的標(biāo)志。GREF等人發(fā)現(xiàn)適用于乳霜配方的維生素C-角鯊烯偶聯(lián)物作用于離體皮膚之后，可顯著增加表皮厚度，并促進(jìn)膠原蛋白Ⅲ和糖胺聚糖的產(chǎn)生。將離體培養(yǎng)的皮膚外植體局部暴露于銅離子緩沖液中，不影響離體皮膚的活力或組織形態(tài)，且能夠促進(jìn)彈性蛋白、前膠原蛋白Ⅰ和TGF-β1的分泌，起到抵抗皮膚衰老的作用。茶堿通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)、增加褪黑激素水平，維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，拮抗ROS供體甲苯醌的刺激作用，從而起到抗衰老、抗氧化的作用。此外，離體皮膚還可以被用來進(jìn)行化妝品配方篩選，例如，藍(lán)銅肽和透明質(zhì)酸是常見的兩種護(hù)膚成分，將兩者組合對(duì)Ⅳ型膠原蛋白的生成具有協(xié)同作用，研究人員發(fā)現(xiàn)二者在1:9的比例下可將膠原蛋白Ⅳ的合成提高2.03倍。
屏障修護(hù)功效
圖：FLG免疫熒光染色典型圖
皮膚作為人體最大的器官在保護(hù)人體免受有害物質(zhì)的入侵中發(fā)揮著重要的作用，其中皮膚屏障在其中起關(guān)鍵作用。皮膚屏障是由角質(zhì)層、角質(zhì)細(xì)胞間脂類及天然保護(hù)因子構(gòu)成，90%的皮膚屏障功能依賴于角質(zhì)層。角質(zhì)層的形成涉及幾種重要的角蛋白中間絲相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括絲聚合蛋白（Filaggrin）、兜甲蛋白（Loricrin）、內(nèi)披蛋白（Involucrin）、小分子富含脯氨酸蛋白（SPRPS）等。
圖：LOR免疫熒光染色典型圖
研究人員發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)48小時(shí)的全層皮膚可保持屏障特性，且能對(duì)不同強(qiáng)度的屏障破壞做出反應(yīng)，使用膠帶剝離或4小時(shí)十二烷基硫酸鈉（SLS）處理通過破壞皮膚結(jié)構(gòu)、促進(jìn)炎癥因子IL-6、IL-8的表達(dá)破壞皮膚屏障。使用1:1（v:v）乙醚：丙酮混合物對(duì)離體皮膚進(jìn)行損傷造模，PPAR-α激動(dòng)劑RFV3可通過增加神經(jīng)酰胺、絲聚蛋白和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1的表達(dá)來促進(jìn)離體皮膚的屏障修護(hù)過程。離體皮膚模型還被用來評(píng)估清潔產(chǎn)品的功效，ZHOU等人通過對(duì)沐浴露A和沐浴露B處理的離體皮膚進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與水對(duì)照和沐浴露A處理相比，經(jīng)沐浴露B處理的離體皮膚在處理7天后，顆粒層和角質(zhì)層中絲聚蛋白的表達(dá)顯著減少，證明沐浴露B對(duì)皮膚屏障具有破壞作用，此外，使用MTT檢測(cè)離體皮膚的組織活力也是用來評(píng)價(jià)皮膚屏障修護(hù)功效的重要指標(biāo)。
抗糖化功效
糖化反應(yīng)，又稱美拉德反應(yīng)，其晚期糖基化產(chǎn)物也被稱為AGEs，AGEs隨著年齡不斷累積，一方面會(huì)通過改變真皮ECM的功能使細(xì)胞形態(tài)改變，另一方面會(huì)通過激活下游信號(hào)通路，影響細(xì)胞、組織功能，促進(jìn)皮膚衰老。具有抗糖基化活性的天然化合物可能具有較大的抗衰老潛力。糖基化誘導(dǎo)劑甲基乙二醛（MGO）可誘導(dǎo)糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)生，在MGO造模的情況下，SHIN等人利用離體皮膚研究了沒食子酸甲酯的抗糖化作用，沒食子酸甲酯通過降低羧甲基賴氨酸（CML）的表達(dá)、刺激纖維蛋白I的表達(dá)來發(fā)揮其抗糖化作用。另一項(xiàng)在離體皮膚中的研究表明，氨基胍、葛根素、綠原酸可促進(jìn)纖維蛋白I的產(chǎn)生和抑制CML的產(chǎn)生，這表明這些活性成分具備抗氧化和抗糖化的功效。此外，與MGO處理相比，水飛薊花提取物水飛薊賓涂抹8天，可顯著降低皮膚外植體中CML的表達(dá)。
保濕功效
充足的水分是皮膚保持健康和正常功能的基礎(chǔ)，皮膚保持水分的能力主要與角質(zhì)層有關(guān)，角質(zhì)層起到防止水分流失的作用，這一作用主要與天然保濕因子和角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)有序排列形成的跨表皮失水屏障有關(guān)。水通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（AQP3）以及顆粒層和角質(zhì)層交界處緊密連接結(jié)構(gòu)在皮膚水分保持和屏障功能中發(fā)揮作用。透明質(zhì)酸（HA）是一種內(nèi)源性皮膚基質(zhì)成分，具有保濕、抗炎等特性，對(duì)維持正常的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)和表皮的屏障功能至關(guān)重要。含有透明質(zhì)酸的化妝品配方可以增強(qiáng)皮膚結(jié)構(gòu)、滋潤(rùn)皮膚、減少皺紋。
圖：ELISA檢測(cè)透明質(zhì)酸HA含量
已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了使用離體皮膚模型研究化妝品及其原材料的保濕功效，例如化妝品配方原料綠咖啡油（GCO）孵育離體皮膚，可顯著增加AQP3的表達(dá)，以此來改善皮膚生態(tài)，防止表皮干燥。全反式維甲酸（ATRA）的局部處理可顯著增加離體皮膚表皮基底層中AQP3的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫反應(yīng)性。使用不同濃度的視黃醇連續(xù)處理離體皮膚，使用生物素化抗透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（HABP）抗體進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的視黃醇配方促進(jìn)了離體皮膚中HA的產(chǎn)生，且視黃醇通過促進(jìn)皮膚組織中HAS3基因的表達(dá)來增強(qiáng)皮膚的保濕作用。此外，另有一項(xiàng)研究使用離體皮膚和ELISA檢測(cè)方法，對(duì)比了高分量和低分子量的HA配方處理后HA在角質(zhì)層中的擴(kuò)散情況，并為人體臨床試驗(yàn)提供了最佳建議。
透皮吸收
物質(zhì)的透皮吸收是指其作用于皮膚表面后進(jìn)入表皮或真皮，并在該部位聚集并發(fā)揮功效的過程?；瘖y品在皮膚中的滲透性是其發(fā)揮功效的重要前提，研究物質(zhì)在皮膚中的滲透與分布，可為產(chǎn)品配方優(yōu)化、功效評(píng)價(jià)等提供重要的數(shù)據(jù)支持，而離體皮膚是研究物質(zhì)透皮吸收不可或缺的模型。
圖：環(huán)特生物離體皮膚拉曼光譜成像典型圖
將離體皮膚與Franz擴(kuò)散法、高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，是目前普遍且應(yīng)用廣泛的化妝品透皮吸收檢測(cè)技術(shù)。已有研究人員利用此方法探究輔酶Q10的卵磷脂微乳液和親水乳膏配方對(duì)皮膚滲透性的影響。二氫槲皮素是具有抗氧化活性的黃酮醇，通過離體皮膚的Franz擴(kuò)散-HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二氫槲皮素水包油乳液的滲透性可達(dá)到48.09%每劑，且HPLC檢測(cè)具有精確性（CV<5%）、準(zhǔn)確性（回收率在98%和102%之間）、線性（R2>0.99）。雖然HPLC對(duì)待測(cè)物質(zhì)的滲透性有著精準(zhǔn)地檢測(cè)，但此種方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的滲透性進(jìn)行可視化的分析，將離體皮膚、Franz擴(kuò)散法與拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合極大地彌補(bǔ)了這一缺口。拉曼光譜是一種振動(dòng)光譜，是物質(zhì)的一種固有屬性，已被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的成分鑒定、分子結(jié)構(gòu)、譜線特征等研究。有文獻(xiàn)報(bào)道了使用拉曼光譜成像技術(shù)檢測(cè)水楊酸在皮膚中滲透行為，水楊酸的濃度分布以熱圖的形式展現(xiàn)，拉曼光譜成像結(jié)果與HPLC結(jié)果得到的目標(biāo)濃度變化趨勢(shì)一致。KANG等人將拉曼光譜與多元線性回歸算法結(jié)合，通過計(jì)算待測(cè)物的濃度貢獻(xiàn)因子，將其分布情況可視化為熱圖，并采用次方法獲得了透明質(zhì)酸和利多卡因在皮膚中的滲透圖像。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明離體皮膚模型和拉曼光譜技術(shù)在化妝品透皮吸收研究中的可靠性和可視化性。
04、結(jié)語(yǔ)與展望
不同于新興的3D重組皮膚模型、皮膚類器官和器官芯片模型，離體皮膚雖然擁有較為久遠(yuǎn)的發(fā)展歷史，但由于其具有倫理限制、獲取困難、個(gè)體差異等特殊的局限性，在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用并不廣泛。與傳統(tǒng)的細(xì)胞模型相比，離體皮膚不僅可以在分子細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的評(píng)估，更能在組織水平評(píng)估待測(cè)物的功效，具有良好的可視化和宣傳效果。已有大量的研究表明，離體皮膚是研究經(jīng)皮給藥、化妝品及原材料功效、藥品和化妝品安全性、刺激性和毒性的有效替代模型，也逐漸被國(guó)內(nèi)外藥品和化妝品的原料商、出品方、監(jiān)管機(jī)構(gòu)和消費(fèi)者所認(rèn)可。離體皮膚在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用或?qū)浹a(bǔ)化妝品安全性和功效評(píng)價(jià)體系的缺口。然而，目前國(guó)內(nèi)外仍缺乏離體皮膚用于化妝品功效評(píng)價(jià)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)督管理規(guī)范，未來可通過起草離體皮膚評(píng)價(jià)方法的技術(shù)指南、制定離體皮膚用于化妝品功效評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范、完善化妝品安全監(jiān)管的法律法規(guī)文件，進(jìn)一步提高離體皮膚模型在行業(yè)內(nèi)的認(rèn)可度、擴(kuò)大離體皮膚模型在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。
隨著新原料的開發(fā)和化妝品技術(shù)的不斷發(fā)展，化妝品行業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)也日漸激烈，這些現(xiàn)狀對(duì)化妝品及其原材料的功效評(píng)價(jià)方法的開發(fā)和模型的建立提出了更多需求，也對(duì)用于化妝品功效宣稱的評(píng)價(jià)體系提出了更全面的要求?；瘖y品及其原材料種類繁多、作用機(jī)制復(fù)雜，單一的評(píng)價(jià)方法或使用單一的評(píng)價(jià)模型難以全面、科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其功效。因此，在進(jìn)行化妝品功效評(píng)價(jià)或驗(yàn)證的過程中，應(yīng)采取多指標(biāo)、多模型、多維度的檢測(cè)，形成綜合、高效、系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系。
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