Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒利用FITC標記的Annexin V作為探針來檢測細胞早期凋亡的發生，這使得它成為細胞凋亡檢測實驗中最常用的探針組合。

檢測原理

在細胞凋亡的早期階段，細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞質轉移到細胞外空間，暴露于外部環境，并增加細胞膜的通透性，從而被特異性針對PS的Annexin-V探針標記。

Annexin-V是一種依賴鈣的磷脂結合蛋白，對PS具有很強的親和力。PI是一種經濟且穩定的核酸染料，它不能穿透正?；蛟缙诘蛲黾毎耐暾毎ぃ軌虼┩竿砥诘蛲龊蛪乃兰毎募毎?，使細胞核呈現紅色。

當Annexin V與PI聯合使用時，PI被排除在活細胞和早期凋亡細胞之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞則同時被FITC和PI雙重染色。
 

圖1. Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測原理

流式細胞分析

FITC具有最大激發波長488納米和最大發射波長525納米。FITC的綠色熒光在FL1通道被檢測。

PI-DNA復合物的最大激發波長為535納米，最大發射波長為615納米。PI的紅色熒光在FL2或FL3通道被檢測。
 

圖2. Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測結果

在凋亡實驗中，經常出現假陽性或與預期不符的結果?？赡艿脑虬ㄑa償調整不當、細胞濃度過高、消化過度、藥物干擾、藥物處理時間過長、樣本自身問題等因素。接下來，我將向您展示如何獲得完美的結果圖像。

01. 補償調整不當：當激光激發時，熒光團在不同波長發射熒光。理論上，每種熒光都可以通過選擇合適的濾光片，由相應的探測器檢測到，而不受其他熒光團的干擾。然而，這些熒光團目前的發射光譜范圍較寬。盡管它們的發射峰值不同，但在發射光譜范圍內存在一定的重疊。換句話說，相鄰的探測器會檢測到彼此的熒光信號，影響檢測結果的準確性。因此，在多色分析中必須進行光譜重疊校正。
 

圖3. FITC和PI的發射光譜

調整方法：設置對照

空白管：使用未經染料處理的誘導凋亡的細胞，來調整熒光通道的光電倍增管電壓。

單染管：需要分別含有僅PI和用熒光標記的Annexin V的管子，來調整兩個熒光通道的補償值。熒光團之間的補償值應該保持不變。在雙熒光染色時，如果一個熒光信號強而另一個弱，就必須進行補償。補償只應該應用于由相同激光激發的不同熒光團之間，以避免補償不足和過度補償。[3]
 

02. 細胞濃度過高：細胞濃度過高會導致培養基迅速消耗，從而引起因饑餓導致的凋亡。因此，應努力確保在誘導細胞凋亡之前細胞處于最佳狀態。隨后，應進行凋亡誘導處理，以避免因細胞衰老引起的凋亡。

圖4. 細胞濃度過高導致自發性凋亡，空白對照組（左），實驗組（右）

03. 細胞消化過度：對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟，消化液應含有不含EDTA的胰蛋白酶，因為Annexin V與PS的結合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+的螯合劑。使用含有EDTA的胰蛋白酶可能導致假陰性結果。在細胞消化過程中，胰蛋白酶可以鋪滿培養板底部，并輕輕搖晃以確保與細胞充分接觸。然后，應去除大部分胰蛋白酶，用剩余的少量胰蛋白酶進行進一步消化。當細胞間隙增大，瓶底出現斑點時，可以停止消化。需要輕柔地吹打以避免過度消化和機械損傷，這兩者都可能對細胞膜造成損害，導致假陽性結果。

圖5. 細胞消化過度導致89.15%的細胞進入早期凋亡狀態

04. 凋亡誘導藥物的熒光干擾：在下圖中，未經處理的空白對照組（左）顯示早期凋亡細胞占3.38%，晚期凋亡細胞占6.64%。然而，在右側的圖像中，Q1和Q2象限中的細胞占90%，幾乎所有細胞在PI通道產生熒光，表明藥物存在熒光干擾。因此，在選擇合適的試劑盒時，應盡量避免藥物和細胞內源性熒光信號的干擾。

圖6. 藥物本身引起的熒光干擾：空白對照組（左）和用藥物處理的細胞（右）。
 

05. 樣本存放時間過長或藥物處理時間過長：樣本處理后，應盡快進行流式細胞分析。樣本存放時間過長或藥物處理時間過長也可能導致細胞進入晚期凋亡和壞死階段。如下圖所示，空白對照組顯示正常結果，但藥物處理組顯示出大量晚期凋亡細胞，這表明藥物處理時間過長可能是原因所在。

圖7. 藥物處理時間過長：空白對照組（左）和用藥物處理的細胞（右）

06. 檢測樣本：神經細胞

(1) 如果檢測樣本為神經細胞，神經細胞膜容易受損和翻轉，導致假陽性。因此，用于檢測細胞凋亡的Annexin V/PI雙重染色流式細胞儀方法不適用于神經細胞。

(2) 檢測樣本來源：血液

如果樣本來源于血液，必須從血液中去除血小板。血小板含有PS，能夠與Annexin V結合，干擾實驗結果。為了去除血小板，可以使用含有EDTA的緩沖液，隨后進行200 g的離心處理。