編者按

 心血管疾病已成為人類主要死亡原因，先天性心臟缺陷是最常見的人類先天缺陷，但在創建用于心血管疾病和先天性心臟病研究的類器官模型方面取得的進展明顯落后于其他器官（例如腎臟、結腸、腸、腦）。因此，現在迫切需要一種更接近于真實人類心臟的體外模型，使我們能夠更好地研究并進行轉化應用。

今天，我們特別關注一項2021年8月由美國密歇根州立大學研究團隊在Nature Communications（IF=14.7）上發表的研究成果，該研究建立了一種使用人類多能干細胞通過自組裝生成與發育相關的人類心臟類器官的方法，并將該心臟類器官用于孕前糖尿病誘發的先天性心臟病建模，為人類先天性心臟病分子病理模型提供了一種新方案。

文章題目

Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiacdevelopment and congenital heart disease

雜志：Nature Communications（IF=14.7）

發表時間：2021.8

作者：Aitor Aguirre等

單位：美國密歇根州立大學等

01、研究結果

1. Wnt信號調節產生自組裝的人心臟類器官

研究人員發現第一次Wnt激活的最佳條件對于成功的心臟類器官形成至關重要。在第0天暴露于不同濃度的CHIR99021（1µM、2µM、4µM、6.6µM和8µM）中24小時，然后在分化第15天通過共聚焦顯微鏡評估hHOs的心臟譜系形成。所有人類胚胎干細胞（hESC）和誘導多能干細胞（hiPSC）的最佳心源性中胚層誘導是在1-4μM CHIR99021濃度下，而不是單層方法報道的典型的10-12µM范圍。研究人員認為在較低的CHIR濃度下，分化的增強可歸因于內源性形態素的產生，分化第0天至第19天之間RNA測序分析通過揭示基本心臟發育形態因子和生長因子及其各自受體的逐步產生支持了這一假設。

為了增加類器官復雜性并產生更多與發育相關的結構，研究人員開發了一種在分化第7-9天基于第二次Wnt激活步驟誘導心外膜前器官分化的方法。通過測試不同濃度（2、4、6和8µM）和暴露時間（1、2、12、24、24和48 h），確定了CHIR99021激活第二次Wnt的條件。

在第15天通過心外膜成像和心外膜（WT1（TNNT2）標記物的定量評估心外膜細胞和心肌細胞形成的效率，發現該處理顯著促進了心外膜前細胞和心外膜細胞的形成。

圖1

2. 轉錄組學分析顯示hHOs密切接近人類胎兒心臟發育，并產生所有主要的心臟細胞譜系

為了描述hHOs細胞群的發育步驟和分子特征，研究人員在整個hHO形成過程中進行了轉錄組學分析。在分化的不同時間點（第0天至第19天）收集hHOs進行rna測序。無監督K-means聚類分析顯示類器官進展了三個主要發育階段：第0天第1天，與多能性和早期中胚層承諾相關；第3天，與早期心臟發育相關；第9天第19天，與胎兒心臟成熟相關。

為了比較hHOs的心臟發育與先前現有方法的心臟發育，研究人員使用先前建立的方案對單層iPSC衍生的心臟分化細胞進行了RNA測序。將RNA-seq結果與之前報道的單層心臟分化協議和人類胎兒心臟組織（胎齡57-67天）（“GSE106690”）的公開數據集進行了比較。在所有情況下，調節第一和第二心臟場規范的hHO心臟發育轉錄因子表達（分別為FHF，SHF）與在單層psc來源的心臟分化中觀察到的相似，并與在胎兒心臟組織中觀察到的一致?；虮磉_譜顯示，與經歷單層分化的細胞相比，hho具有更高的心肌細胞譜系復雜性，特別是在心外膜、內皮、心內膜和心臟成纖維細胞群體中。這些數據表明，hHOs的結構和細胞復雜性顯著富集，從而使其與胎兒心臟一致。

圖2

3. 心臟類器官產生多種心臟特異性細胞譜系

轉錄組學分析結果（圖2）表明，第二次CHIR99021暴露導致其他間充質譜系的形成，由于誘導心外膜前器官的形成，hHOs的復雜性更高。為了評估這一發現，研究人員對繼發性心臟細胞譜系進行了免疫熒光分析。共聚焦成像證實存在THY1和VIM陽性的心臟成纖維細胞（圖3a），與胎兒心臟的組成相似。對心內膜標記物NFATC1的免疫熒光分析顯示，心內膜層的形成（圖3b）。

進一步成像顯示，在第11天和第13天之間，內皮細胞（PECAM1 +）形成一個強大的互聯網絡，形成血管狀結構。高倍圖像顯示心肌組織附近或嵌入一個復雜的內皮細胞網。這些結果強烈表明，在hHO發育過程中，內皮血管結構出現，為類器官增加了一個血管網絡。

圖3

4. 人類心臟類器官再現了心臟場的發育和房室的規范

第一和第二心臟場（FHF，SHF）是在發育中的心臟中發現的兩個細胞群，在心臟發育過程中起著關鍵作用。第7天hHO冷凍切片的免疫熒光顯示，FHF和SHF祖細胞都存在并分離到各自的心臟區域。

在人類心臟中，左心室最終由FHF祖細胞形成，而心房則由SHF祖細胞形成，因此，研究人員試圖確定我們的hho是否包含屬于心房或心室譜系的心肌細胞。在第15天的hHOs中，MYL2（編碼肌凝蛋白輕鏈-2，心室亞型）和MYL7（編碼肌凝蛋白輕鏈-7，心房亞型）的免疫熒光顯示，這兩種亞型的心肌細胞均呈陽性。這兩個不同的群體定位于類器官的不同區域，并且很接近，這反映了人類心臟的表達模式。通過RNA-seq在整個分化方案中也觀察到HAND1、HAND2和MYL7轉錄本的表達。這些數據表明，hho的分化包括心臟場形成、房室規范和心室形成。

圖4

5. BMP4和Activin A改善心臟類器官腔的形成和血管形成

研究人員嘗試了BMP4和Activin A的分別在1.25 ng/ml和1 ng/ml，與4µM CHIR99021一起作用24小時。對照組和治療組hHOs之間的心?。═NNT2+）或心外膜（WT1+/TJP1+）組織的形成無顯著差異（圖5a）。

然而，當經生長因子處理的hHOs的直徑約大15%，這種差異可能與腔室連通性的增加相對應，因為BMP4/Activin A處理的hHOs具有內部腔室樣腔，與對照hHOs相比，與其他腔室的連通性增加了50%（圖5d，e）。用BMP4和Activin A處理的類器官的免疫熒光分析顯示，PECAM1+細胞也增加了160%，表明對類器官血管化有顯著影響（圖5f，g）。這些結果表明，在BMP4/ActA下發育的類器官結構組織得到改善。

圖5

6. 心臟類器官具有發育中的人類心臟的功能和結構特征

傳統的成像方法，如共聚焦成像，不適合研究hho中復雜的三維結構。因此，我們使用了光學相干斷層掃描（OCT），使用微創的方法來表征腔室的特性，從而保留了腔室的物理和形態特性。OCT顯示第15天hho內清晰的腔室空間。內部hHO拓撲的三維重建顯示這些腔室之間高度互聯，顯示靠近器官中心的4-6個腔室顯，范圍從5.5e−4mm3到1.3e−2mm3。

圖6

02、編者點評

總體而言，本研究構建出了一種使用人類多能干細胞自組裝生成與發育相關的人類心臟類器官的方法，該類器官通過使用化學抑制劑和生長因子的三步Wnt信號調節策略生成，在轉錄組學、結構和細胞水平上與人類胎兒心臟組織一致，并呈現多細胞類型和形態復雜性，包括了發育過程中腔室形成、電生理活動和血管化；作者團隊還將該心臟類器官用于對孕前糖尿病誘發的先天性心臟病進行建模，因此可能成為未來研究人類先天性心臟病分子病理學的有利模型。

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