嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞治療技術近年來在臨床上不斷取得突破，特別是靶向CD19的CAR-T細胞在治療B細胞來源的血液腫瘤上取得了令人矚目的成果，使其成為了當下CAR-T細胞治療中最熱門的靶點。在CD19 CAR-T細胞開發生產過程中，CD19 CAR表達情況的檢測是關鍵環節，目前，針對CD19 CAR的檢測多采用聚合酶鏈反應和流式細胞術。

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下面，小編就以今年2月MacLeod et al.在Molecular Therapy發表的一篇關于基因編輯同種異體CD19 CAR-T制備方法優化的文章（Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells）為例，為大家簡要解讀如何利用流式細胞術檢測CD19 CAR-T細胞。

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首先，我們來了解一下文章中CD19 CAR-T細胞的構造。 CD19 CAR-T細胞的核心部件為CD19 CAR，主要由CD19的單鏈抗體（克隆號：FMC63）片段（ScFv）、CD8a的鉸鏈和跨膜區、共刺激分子4-1BB和CD3ζ胞內信號區串聯而成（見圖1）。

圖1 CD19 CAR-T細胞結構示意圖

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CD19 CAR 作為CD19 CAR-T細胞的核心部件，其表達情況決定了CD19 CAR-T細胞制備的成敗。文章中MacLeod et al.就是通過檢測CD19 CAR的表達來評估基因編輯同種異體CD19 CAR-T細胞制備成功率。

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接下來，我們就來看一看文章中是如何利用流式細胞術檢測CD19 CAR的表達的。

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流式細胞儀：BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)

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主要試劑：生物素標記的CD19-Fc蛋白 (Cat.# CD9-H8259) 購自ACROBiosystems公司，PE標記的鏈霉親和素（Streptavidin-PE）和anti-CD3-BV711抗體購自BioLegend公司。

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檢測樣品：Mock nucleofected T細胞組 和TRC1-2 nucleofected T細胞組

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檢測原理：生物素-親和素系統、抗原-抗體系統和流式細胞分析技術相結合（見圖2）。

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圖2 流式細胞術檢測T細胞表面CD3分子和CD19 CAR表達的原理示意圖

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檢測簡要流程：

第一步：利用CD19 CAR能特異性結合CD19蛋白的特性，如果待檢T細胞正常表達了CD19 CAR，生物素標記的CD19-Fc蛋白就能被標記到待檢T細胞表面；

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第二步：利用生物素能特異性結合親和素（Streptavidin-PE）和Anti-CD3--BV711抗體能特異性結合CD3分子的特性，如果待檢T細胞表面有生物素和CD3分子，鏈霉親和素上的PE和Anti-CD3抗體上的BV711熒光標記就能被標記到待檢T細胞表面；

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第三步：制備好的單細胞懸液上機進行流式細胞分析。

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檢測結果：利用流式細胞術對兩組待檢T細胞表面CD3分子和CD19 CAR表達情況的檢測結果顯示，CD3陰性T細胞群中CD19 CAR表達的比例要高于CD3陽性T細胞群。

圖3 流式細胞術檢測CD19 CAR-T細胞表面CD3分子和CD19 CAR表達情況

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流式細胞術作為一種在功能水平上對單細胞進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好等諸多優勢，而生物素-親和素系統的高親和力牢固結合和多級放大效應，在與流式細胞術結合使用時，使得細胞定量分析更加靈敏簡便。

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ACROBiosystems作為全球**的蛋白產品生產商，擁有專業化的生物素標記平臺，專注于為腫瘤免疫治療領域提供高品質生物素標記蛋白產品。

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參考文獻：

[1] MacLeod et al., Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.02.005

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