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近年來，全球生物制藥發(fā)展異常迅猛，新的生物藥分析檢測技術(shù)亦層出不窮，SPR 技術(shù)作為其中一員，憑借著其突出的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和高重復(fù)性，在 2016 年被正式收錄到美國和日本的藥典（見「美國藥典USP39 General Information /（1105）Immunological Test Methods- Surface Plasmon Resonance 章節(jié)」和「日本藥典 2016 版 JP17 General Information / Biotechnological / Biological Products- Surface Plasmon Resonance，Page 2474-2478 頁」）。小編懷著強烈的好奇心，在「SPR 技術(shù)知識」的海洋中游走多天，終于撈到了一點點干貨，給大家分享一下。

Q1 什么是 SPR？

SPR（Surface plasmon resonance），被稱為表面等離子體共振，又稱表面等離激元共振，本質(zhì)上是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。

Q2 SPR 技術(shù)檢測原理是什么？

首先，回顧幾個物理概念：

等離子體：通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等，對外呈現(xiàn)電中性，是物質(zhì)存在的一種狀態(tài)，與固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)并列，成為物質(zhì)的第四態(tài)，宇宙中大部分物質(zhì)處于等離子狀態(tài)。

金屬表面等離子波：把金屬的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體，這實際上也是一種等離子體。因為金屬中的價電子可以自由移動，入射光可能激起電子氣的縱向振動，振動產(chǎn)生的電荷密度波，沿著金屬和電介質(zhì)的界面?zhèn)鞑ィ纬杀砻娴入x子波。

消逝波：當(dāng)以波動光學(xué)的角度來研究全反射時，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達界面時并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質(zhì)，而光的總能量沒有發(fā)生改變，則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波（見下圖）。



現(xiàn)在，我們來看看 SPR 的檢測原理：

當(dāng)光源發(fā)出的 P 偏振光（電磁波）以一定的角度入射到棱鏡中，在棱鏡與金屬的界面處將發(fā)生反射和折射，當(dāng)入射角大于臨界角時，光線將發(fā)生全內(nèi)反射，在全內(nèi)反射的情況下，電場在金屬與棱鏡的界面處并不立即消失，而是向金屬介質(zhì)中傳輸振幅呈指數(shù)衰減的消逝波，同時引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子波，當(dāng)金屬表面等離子波與消逝波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強度會大幅度地減弱，能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被金屬表面等離子波吸收，使得反射光的能量急劇減少。當(dāng)入射光波長固定時，反射光強度是入射角的函數(shù)，其中反射光強度最低時所對應(yīng)的入射角為共振角（Resonance Angle）。表面等離子共振（SPR）對附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感，當(dāng)表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時，共振角將不同。因此，SPR 譜（共振角的變化 VS 時間）能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化。



上圖中展示的是 SPR 芯片工作原理， 這里的 SPR 芯片指的是一個帶有葡聚糖（Dextran）的金屬表面（Mental Surface），而配體蛋白（Ligand）的氨基端可以與葡聚糖結(jié)合從而被固定到金屬表面。下方光源發(fā)出的一個單波長激光束進入到棱鏡（Prism）中，導(dǎo)致多角度的光線入射到金屬表面，幾乎所有入射的光線都會發(fā)生反射，但有一個例外，在入射角達到某一個角度時，光子的能量會被金屬吸收轉(zhuǎn)化成表面等離子體波，在這個角度沒有光線被反射出來，而是以很小的強度被檢測器檢測到，這個角度被稱為共振角。由于等離子體波會在金屬表面?zhèn)鞑ィ?STRONG>金屬表面偶聯(lián)的配體蛋白與任何物質(zhì)發(fā)生相互作用都將導(dǎo)致共振角發(fā)生改變。





這兩張圖是對 SPR 芯片工作原理的進一步解釋：A 圖中有一偶聯(lián)了抗原的芯片，當(dāng)樣本流過芯片，抗體與抗原結(jié)合，導(dǎo)致樣本通道（Sample Channel 2）的共振角發(fā)生改變，而對照通道（Reference Channel 1，是沒有偶聯(lián)抗原的對照表面）共振角不發(fā)生改變，此時利用這兩個通道共振角之差（Channel2-Channel 1）繪制出的共振單位 RU（Resonance Units）隨時間變化的曲線是一個向上的曲線，當(dāng)樣本被洗去且抗體開始從抗原結(jié)合處解離下來，此時出現(xiàn)的傳感曲線是一個向下的曲線。B 圖顯示的是結(jié)合多個蛋白的情況，當(dāng)抗體結(jié)合到抗原上時出現(xiàn)的傳感曲線是一個向上的曲線，之后如果有另一個包含抗體的受體的樣本流過芯片，則會在上一個曲線基礎(chǔ)上向上形成另一個曲線。

Q3 SPR 技術(shù)的發(fā)展歷程是怎樣的？

1902 年 Wood 在光學(xué)實驗中發(fā)現(xiàn) SPR 現(xiàn)象；
1941 年 Fano 解釋了 SPR 現(xiàn)象；
1971 年 Kretschmann 為 SPR 傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)；
1983 年 Liedberg 將 SPR 用于 IgG 與其抗原的反應(yīng)測定；
1987 年 Knoll 等人開始 SPR 成像研究；
1990 年 Biacore AB 公司開發(fā)出首臺商品化 SPR 儀器；
2016 年 SPR 技術(shù)被正式收錄到美國和日本藥典。

Q4 SPR 技術(shù)有哪些用途？

SPR 技術(shù)可用于生物分子間結(jié)合特異性的分析、濃度定量、結(jié)合動力學(xué)和親和力分析以及熱力學(xué)分析，能夠?qū)崟r檢測 DNA 與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間、藥物與蛋白之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間以及受體與配體等生物分子之間的相互作用。

Q5 如何使用 SPR 技術(shù)？

2016 年 SPR 技術(shù)被正式收錄到美國和日本藥典后，越來越多的被應(yīng)用到生物藥的研發(fā)和質(zhì)控中。近期發(fā)表于 Biomaterials 上的一篇關(guān)于改造 Fc 片段作為蛋白藥物載體從而優(yōu)化蛋白藥物給藥途徑的文章中，SPR 技術(shù)被用于對比 FcRn（Cat#FCM-H5286, ACROBiosystems, Newark, DE）與改造前 Fc 片段和改造后 Fc 片段結(jié)合的動力學(xué)差異，具體實驗流程及結(jié)果如下：

器材：Biacore T100 & CM5 傳感器芯片（GE Healthcare, Pittsburgh, PA）。




主要試劑： soluble human Neonatal Fc-receptor (FcRn, Cat#FCM-H5286, ACROBiosystems, Newark, DE).

簡易流程：

1. 芯片表面預(yù)處理：利用共價結(jié)合將 FcRn 蛋白偶聯(lián)在羧基化處理的葡聚糖芯片（CM5）表面。偶聯(lián)方法分很多種，包括直接偶聯(lián)（氨基偶聯(lián)、巰基偶聯(lián)、醛偶聯(lián)等）和捕獲（親和素—生物素捕獲系統(tǒng)、NTA—6His 捕獲系統(tǒng)等）兩大類。此實驗選擇氨基共價偶聯(lián)：第一步芯片活化，pH 4.5-5 條件下使用交聯(lián)劑 EDC / NHS 使芯片表面酯化；第二步配體偶聯(lián)（配體蛋白純度要求在 90% 以上，用量以 30-50KD 蛋白為例，需準(zhǔn)備蛋白濃度 10-50ug/ml，1ml 左右，隨著蛋白性質(zhì)的不同和分子量的變化可以調(diào)整），將購自 ACROBiosystems 的 FcRn 蛋白偶聯(lián)到 CM5 芯片表面（酯化后的芯片表面酯基和 FcRn 蛋白上的氨基發(fā)生反應(yīng)）；第三步封閉，用 1M 乙醇胺鹽酸鹽（PH8.5）封閉芯片上多余的有活性的羧基。此次實驗 FcRn 最終偶聯(lián)水平為 ~9000RU（Response Units）。



對照表面的設(shè)計：CM5 芯片分 1，2，3，4 四個 Flow Cell 通道，一般 1，2 通道配對使用（1 通道作為參比），3，4 通道配對使用（3 通道作為參比），參比通道對照表面可設(shè)計成空白表面、活化-封閉無配體固定的表面或偶聯(lián)了偽裝配體的表面。此次實驗參比通道對照表面選擇活化-封閉無配體固定的方式來做削減對照，當(dāng)對進樣過程進行分析時，對照表面的削減可用來消除因樣品溶解緩沖液與儀器運行緩沖液成分不同所造成的容積差及一些非特異性結(jié)合信號。

2. 進樣：首先用運行緩沖液（50 mM phosphate, 100 mM sodium chloride, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 6.0 or 7.4）稀釋樣本，此實驗樣本有 recombinant Fc （重組Fc蛋白），sc（Fc）2 （單鏈Fc二聚體）， hGH-Fc（人生長激素—Fc融合蛋白）和 hGH-sc（Fc）2 （人生長激素—單鏈Fc二聚體融合蛋白）四種。進樣時間為 2min（重組Fc蛋白組為 1min 除外），進樣流速 20ul/min， 蛋白解離時間為 2.5min。

3. 芯片再生：殘留蛋白用再生緩沖液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 7.4)）洗脫下來，時間為 30sec，流速設(shè)為 30ul/min。

4. 數(shù)據(jù)分析：Biacore T100 評價軟件（version2.0.2）分析生成傳感圖。

SPR 傳感圖結(jié)果展示：




上圖是 PH6.0 條件下，連續(xù)兩倍稀釋法稀釋的四種待測樣本分別與 CM5 芯片上偶聯(lián)的 FcRn（Cat#FCM-H5286，ACROBiosystems，Newark，DE）結(jié)合的實時動態(tài)分析結(jié)果圖，圖中對應(yīng)樣本分別是：（A） Fc （稀釋梯度為 400 nM to 6.25nM），（B） sc（Fc）₂ （稀釋梯度為 3,200 nM to 6.25 nM），（C）hGH- sc（Fc）₂（稀釋梯度為 6,400 nM to 50 nM）， and （D）hGH-Fc（稀釋梯度為 6,400 nM to 6.25 nM）。

除了上文中提到的應(yīng)用外，SPR 技術(shù)在 EMA 和 FDA 批準(zhǔn)上市的藥物中也有著廣泛的應(yīng)用，比如西妥昔單抗（Cetuximab）藥物質(zhì)控中，SPR 技術(shù)被用于藥物分子的親和力檢測和血藥濃度測定^[6]，再比如 IL-17 單抗（Ixekizumab）藥物研發(fā)中，SPR 技術(shù)被用于檢測藥物分子與靶點 IL-17A 的親和力和動力學(xué)數(shù)據(jù)，用于對比藥物分子與同源二聚體 IL-17A 和異源二聚體 IL-17A / F 結(jié)合的動力學(xué)差異^[7]。現(xiàn)如今 SPR 技術(shù)的應(yīng)用不勝枚舉，尤其在新藥和生物類似藥研發(fā)的領(lǐng)域中得到廣泛認(rèn)可。

參考文獻：

[1] Sabban, Sari. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high- affinity FcεRI receptor (PhD thesis), The University of Sheffield, 2011.

[2] Liedberg, Bo, et al. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4(1983): 299–304, doi:10.1016/0250-6874(83)85036-7.

[3] Zhou L, et al. Single chain Fc-dimer-human growth hormone fusion protein for improved drug delivery, Biomaterials (2016), doi:10.1016/j.biomaterials.2016.11.051.

[4] A.R. Mezo, et al. Reduction of IgG in nonhuman primates by a peptide antagonist of the neonatal Fc receptor FcRn, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105 (2008) 2337-2342.

[5] 程慧，黃朝峰。SPR 生物傳感器及其應(yīng)用進展。中國生物工程雜志。2003，23(5)：46-49.

[6] Erbitux, INN-Cetuximab - European Medicines Agency 2004 (http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/human/000558/WC500029113.pdf)

[7] Ling liu, et al. Generation and characterization of ixekizumab,a humanized monoclonal antibody that neutralizes interleukin-17A. J Inflamm Res. 2016; 9: 39-50. doi: 10.2147/JIR.S100940.

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