近年來，全球生物制藥發展異常迅猛，新的生物藥分析檢測技術亦層出不窮，SPR 技術作為其中一員，憑借著其突出的準確性、穩定性和高重復性，在 2016 年被正式收錄到美國和日本的藥典（見「美國藥典USP39 General Information /（1105）Immunological Test Methods- Surface Plasmon Resonance 章節」和「日本藥典 2016 版 JP17 General Information / Biotechnological / Biological Products- Surface Plasmon Resonance，Page 2474-2478 頁」）。小編懷著強烈的好奇心，在「SPR 技術知識」的海洋中游走多天，終于撈到了一點點干貨，給大家分享一下。

Q1 什么是 SPR？

SPR（Surface plasmon resonance），被稱為表面等離子體共振，又稱表面等離激元共振，本質上是一種物理光學現象。

Q2 SPR 技術檢測原理是什么？

首先，回顧幾個物理概念：

等離子體：通常指由密度相當高的自由正、負電荷組成的氣體，其中正、負帶電粒子數目幾乎相等，對外呈現電中性，是物質存在的一種狀態，與固態、液態和氣態并列，成為物質的第四態，宇宙中大部分物質處于等離子狀態。

金屬表面等離子波：把金屬的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體，這實際上也是一種等離子體。因為金屬中的價電子可以自由移動，入射光可能激起電子氣的縱向振動，振動產生的電荷密度波，沿著金屬和電介質的界面傳播，形成表面等離子波。

消逝波：當以波動光學的角度來研究全反射時，人們發現當入射光到達界面時并不是直接產生反射光，而是先透過光疏介質約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質，而光的總能量沒有發生改變，則透過光疏介質的波被稱為消逝波（見下圖）。



現在，我們來看看 SPR 的檢測原理：

當光源發出的 P 偏振光（電磁波）以一定的角度入射到棱鏡中，在棱鏡與金屬的界面處將發生反射和折射，當入射角大于臨界角時，光線將發生全內反射，在全內反射的情況下，電場在金屬與棱鏡的界面處并不立即消失，而是向金屬介質中傳輸振幅呈指數衰減的消逝波，同時引發金屬中的自由電子產生表面等離子波，當金屬表面等離子波與消逝波發生共振時，檢測到的反射光強度會大幅度地減弱，能量從光子轉移到表面等離子，入射光的大部分能量被金屬表面等離子波吸收，使得反射光的能量急劇減少。當入射光波長固定時，反射光強度是入射角的函數，其中反射光強度最低時所對應的入射角為共振角（Resonance Angle）。表面等離子共振（SPR）對附著在金屬薄膜表面的介質折射率非常敏感，當表面介質的屬性改變或者附著量改變時，共振角將不同。因此，SPR 譜（共振角的變化 VS 時間）能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化。



上圖中展示的是 SPR 芯片工作原理， 這里的 SPR 芯片指的是一個帶有葡聚糖（Dextran）的金屬表面（Mental Surface），而配體蛋白（Ligand）的氨基端可以與葡聚糖結合從而被固定到金屬表面。下方光源發出的一個單波長激光束進入到棱鏡（Prism）中，導致多角度的光線入射到金屬表面，幾乎所有入射的光線都會發生反射，但有一個例外，在入射角達到某一個角度時，光子的能量會被金屬吸收轉化成表面等離子體波，在這個角度沒有光線被反射出來，而是以很小的強度被檢測器檢測到，這個角度被稱為共振角。由于等離子體波會在金屬表面傳播，所以金屬表面偶聯的配體蛋白與任何物質發生相互作用都將導致共振角發生改變。





這兩張圖是對 SPR 芯片工作原理的進一步解釋：A 圖中有一偶聯了抗原的芯片，當樣本流過芯片，抗體與抗原結合，導致樣本通道（Sample Channel 2）的共振角發生改變，而對照通道（Reference Channel 1，是沒有偶聯抗原的對照表面）共振角不發生改變，此時利用這兩個通道共振角之差（Channel2-Channel 1）繪制出的共振單位 RU（Resonance Units）隨時間變化的曲線是一個向上的曲線，當樣本被洗去且抗體開始從抗原結合處解離下來，此時出現的傳感曲線是一個向下的曲線。B 圖顯示的是結合多個蛋白的情況，當抗體結合到抗原上時出現的傳感曲線是一個向上的曲線，之后如果有另一個包含抗體的受體的樣本流過芯片，則會在上一個曲線基礎上向上形成另一個曲線。

Q3 SPR 技術的發展歷程是怎樣的？

1902 年 Wood 在光學實驗中發現 SPR 現象；
1941 年 Fano 解釋了 SPR 現象；
1971 年 Kretschmann 為 SPR 傳感器結構奠定了基礎；
1983 年 Liedberg 將 SPR 用于 IgG 與其抗原的反應測定；
1987 年 Knoll 等人開始 SPR 成像研究；
1990 年 Biacore AB 公司開發出首臺商品化 SPR 儀器；
2016 年 SPR 技術被正式收錄到美國和日本藥典。

Q4 SPR 技術有哪些用途？

SPR 技術可用于生物分子間結合特異性的分析、濃度定量、結合動力學和親和力分析以及熱力學分析，能夠實時檢測 DNA 與蛋白質之間、蛋白質分子之間、藥物與蛋白之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間以及受體與配體等生物分子之間的相互作用。

Q5 如何使用 SPR 技術？

2016 年 SPR 技術被正式收錄到美國和日本藥典后，越來越多的被應用到生物藥的研發和質控中。近期發表于 Biomaterials 上的一篇關于改造 Fc 片段作為蛋白藥物載體從而優化蛋白藥物給藥途徑的文章中，SPR 技術被用于對比 FcRn（Cat#FCM-H5286, ACROBiosystems, Newark, DE）與改造前 Fc 片段和改造后 Fc 片段結合的動力學差異，具體實驗流程及結果如下：

器材：Biacore T100 & CM5 傳感器芯片（GE Healthcare, Pittsburgh, PA）。




主要試劑： soluble human Neonatal Fc-receptor (FcRn, Cat#FCM-H5286, ACROBiosystems, Newark, DE).

簡易流程：

1. 芯片表面預處理：利用共價結合將 FcRn 蛋白偶聯在羧基化處理的葡聚糖芯片（CM5）表面。偶聯方法分很多種，包括直接偶聯（氨基偶聯、巰基偶聯、醛偶聯等）和捕獲（親和素—生物素捕獲系統、NTA—6His 捕獲系統等）兩大類。此實驗選擇氨基共價偶聯：第一步芯片活化，pH 4.5-5 條件下使用交聯劑 EDC / NHS 使芯片表面酯化；第二步配體偶聯（配體蛋白純度要求在 90% 以上，用量以 30-50KD 蛋白為例，需準備蛋白濃度 10-50ug/ml，1ml 左右，隨著蛋白性質的不同和分子量的變化可以調整），將購自 ACROBiosystems 的 FcRn 蛋白偶聯到 CM5 芯片表面（酯化后的芯片表面酯基和 FcRn 蛋白上的氨基發生反應）；第三步封閉，用 1M 乙醇胺鹽酸鹽（PH8.5）封閉芯片上多余的有活性的羧基。此次實驗 FcRn 最終偶聯水平為 ~9000RU（Response Units）。



對照表面的設計：CM5 芯片分 1，2，3，4 四個 Flow Cell 通道，一般 1，2 通道配對使用（1 通道作為參比），3，4 通道配對使用（3 通道作為參比），參比通道對照表面可設計成空白表面、活化-封閉無配體固定的表面或偶聯了偽裝配體的表面。此次實驗參比通道對照表面選擇活化-封閉無配體固定的方式來做削減對照，當對進樣過程進行分析時，對照表面的削減可用來消除因樣品溶解緩沖液與儀器運行緩沖液成分不同所造成的容積差及一些非特異性結合信號。

2. 進樣：首先用運行緩沖液（50 mM phosphate, 100 mM sodium chloride, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 6.0 or 7.4）稀釋樣本，此實驗樣本有 recombinant Fc （重組Fc蛋白），sc（Fc）2 （單鏈Fc二聚體）， hGH-Fc（人生長激素—Fc融合蛋白）和 hGH-sc（Fc）2 （人生長激素—單鏈Fc二聚體融合蛋白）四種。進樣時間為 2min（重組Fc蛋白組為 1min 除外），進樣流速 20ul/min， 蛋白解離時間為 2.5min。

3. 芯片再生：殘留蛋白用再生緩沖液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 7.4)）洗脫下來，時間為 30sec，流速設為 30ul/min。

4. 數據分析：Biacore T100 評價軟件（version2.0.2）分析生成傳感圖。

SPR 傳感圖結果展示：




上圖是 PH6.0 條件下，連續兩倍稀釋法稀釋的四種待測樣本分別與 CM5 芯片上偶聯的 FcRn（Cat#FCM-H5286，ACROBiosystems，Newark，DE）結合的實時動態分析結果圖，圖中對應樣本分別是：（A） Fc （稀釋梯度為 400 nM to 6.25nM），（B） sc（Fc）₂ （稀釋梯度為 3,200 nM to 6.25 nM），（C）hGH- sc（Fc）₂（稀釋梯度為 6,400 nM to 50 nM）， and （D）hGH-Fc（稀釋梯度為 6,400 nM to 6.25 nM）。

除了上文中提到的應用外，SPR 技術在 EMA 和 FDA 批準上市的藥物中也有著廣泛的應用，比如西妥昔單抗（Cetuximab）藥物質控中，SPR 技術被用于藥物分子的親和力檢測和血藥濃度測定^[6]，再比如 IL-17 單抗（Ixekizumab）藥物研發中，SPR 技術被用于檢測藥物分子與靶點 IL-17A 的親和力和動力學數據，用于對比藥物分子與同源二聚體 IL-17A 和異源二聚體 IL-17A / F 結合的動力學差異^[7]。現如今 SPR 技術的應用不勝枚舉，尤其在新藥和生物類似藥研發的領域中得到廣泛認可。

參考文獻：

[1] Sabban, Sari. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high- affinity FcεRI receptor (PhD thesis), The University of Sheffield, 2011.

[2] Liedberg, Bo, et al. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4(1983): 299–304, doi:10.1016/0250-6874(83)85036-7.

[3] Zhou L, et al. Single chain Fc-dimer-human growth hormone fusion protein for improved drug delivery, Biomaterials (2016), doi:10.1016/j.biomaterials.2016.11.051.

[4] A.R. Mezo, et al. Reduction of IgG in nonhuman primates by a peptide antagonist of the neonatal Fc receptor FcRn, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105 (2008) 2337-2342.

[5] 程慧，黃朝峰。SPR 生物傳感器及其應用進展。中國生物工程雜志。2003，23(5)：46-49.

[6] Erbitux, INN-Cetuximab - European Medicines Agency 2004 (http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/human/000558/WC500029113.pdf)

[7] Ling liu, et al. Generation and characterization of ixekizumab,a humanized monoclonal antibody that neutralizes interleukin-17A. J Inflamm Res. 2016; 9: 39-50. doi: 10.2147/JIR.S100940.

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