靶向療法指能夠特異性結合致癌分子、抑制致癌分子活性、促使腫瘤細胞死亡而不影響腫瘤周圍正常組織細胞的治療方式。目前針對突變后活性異常升高的致癌分子，部分靶向藥物可有效抑制致癌分子活性，具有很好的療效，但是，對于突變后活性降低的抑癌分子—TP53（tumor protein 53），則需要靶向藥物能夠重新激活其抑制癌變的活性，這對于藥物開發來講是幾乎不可能完成的任務。
2021年3月5日，約翰霍普金斯大學醫學院Zhou Shibin研究組在Science發表論文，報道CD3雙特異性抗體可靶向突變TP53抗原并殺傷腫瘤細胞。這篇文章以生物學機理研究為根基，巧妙地設計出在in vitro和in vivo實驗中均具有高效殺傷腫瘤細胞的CD3雙抗，令人眼前一亮，為開發針對突變TP53的靶向藥物提供了新思路。
P53是人體內最重要的抑癌基因之一，扮演著人體基因組守護者的角色。正因為P53的重要抑癌作用，當其特定位點發生基因突變后，將導致抑癌活性降低，無法阻止癌癥的發生。第175位賴氨酸（R）被組氨酸（H）替換是TP53 中最經常觀察到的突變，也是其它腫瘤抑制基因中最常見的突變形式。P53R175H蛋白會被蛋白酶體降解，酶解片段HMTEVVRHC (帶下劃線的為突變氨基酸)可結合人類白細胞抗原 (HLA) 等位基因 (A*02：01) ，隨后被加工和呈遞到腫瘤細胞表面，產生可被T 細胞受體 (TCR) 可識別的新抗原（圖1）。
圖1. 靶向P53R175H雙抗開發機理圖
基于上述機理，研究人員利用噬菌體展示文庫篩選出23株可特異性識別P53R175H、不識別P53WT的單鏈可變區抗體（scFvs），并將這些抗體同CD3ε抗體UCHT1 scFv組裝成single-chain diabody (scDb)雙抗（圖2）。這類靶向TCR-CD3和抗原分子的雙抗被稱為T 細胞重定向雙特異性抗體，其一端與腫瘤細胞結合，另一端以腫瘤選擇性的方式觸發 T 細胞的細胞毒作用和細胞因子的產生，可有效殺傷腫瘤細胞，占當前雙抗開發種類的40%以上。
通過進一步篩選，H2-scDb這株抗體脫穎而出，其不僅能夠高效激活T細胞分泌細胞因子，且與P53R175H/ HLA-A*02：01結合的特異性最好。
圖2. 靶向TP53 scDb雙抗示意圖
在in vitro實驗中，H2-scDb即使在很低的濃度時依然可以高效激活T細胞釋放顆粒酶、穿孔素和細胞因子，介導腫瘤細胞的殺傷（圖3）。
圖3. H2-scDb in vitro殺傷腫瘤效果
在in vivo實驗中，H2-scDb可顯著抑制小鼠體內異種移植腫瘤的生長，而當腫瘤細胞的P53基因敲除后，腫瘤大小的增長不受到影響（圖4）。
圖4. H2-scDb in vivo殺傷腫瘤效果
為了闡明H2-scDb特異性識別P53R175H的分子機理，研究人員將H2以全長IgG的形式重組表達，然后利用木瓜蛋白酶將IgG酶解成Fab片段，再將H2-Fab與P53R175H/ HLA-A*02：01孵育形成復合物晶體，通過晶體學方法解析了該復合物的空間三維結構（圖5）。
結構分析顯示，P53R175H肽段（HMTEVVRHC）位于HLA-A*02：01分子α1和α2螺旋形成的空腔內，H2-Fab的6個CDR區域均與HLA-A*02：01有相互作用，但只有4個CDR區域與P53R175H肽段有相互作用（H1，H2，H3, L3）。
圖5. H2-Fab與P53R175H/ HLA-A*02：01復合物的晶體結構
這項研究結果證明，針對P53R175H突變開發的雙特異性單鏈抗體 H2-scDb 可以特異性識別和激活 T 細胞，發揮抗腫瘤作用，同時具有良好的安全性。目前這株抗體只在動物模型上獲得了驗證，期待后續這株抗體能夠進入臨床實驗進一步驗證。
常規的抗體治療通常只能結合細胞表面的抗原，而腫瘤中大部分抗原是胞內抗原，這令抗體治療常常束手無策。本研究中開發的H2-scDb抗體可以識別被呈遞到腫瘤細胞表面的抗原肽/MHC 復合物，激活了 T 細胞的抗腫瘤效應，這為針對類似靶點抗體的研發、靶向實體瘤的 CAR-T 細胞療法研發等提供了新的思路和證據。
在這項研究中，研究人員使用了ACROBiosystems開發的CD3E & CD3D異源二聚體蛋白（貨號：CDD-H82W6）用于研究scDb與CD3蛋白的結合，獲得了理想的結果。
ACROBiosystems優化開發了高度均一的高活性CD3δ/ CD3ε, CD3γ/ CD3ε系列產品，經非還原電泳和MALS技術嚴格確認為1:1異源二聚體，在抗體藥物的開發和篩選、抗體藥物的鑒定和質控、以及臨床血藥濃度分析等不同的應用技術平臺中均表現出優異的性能，經雙特異性臨床抗體驗證完全符合藥物開發要求，可加速抗體藥物的開發進程。
1:1異源二聚體，經NR電泳和MALS驗證
Fig.1 Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) on SDS-PAGE under reducing (R) and non-reducing（NR）condition. The purity of the protein was more than 85% and around 35-43 kDa verified by SEC-MALS.
高活性，批間差異小
Fig.2 Immobilized Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 1 μg/mL (100 μL/well) on Streptavidin (Cat. No. STN-N5116) precoated (0.5 μg/well) plate, can bind Monoclonal Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) (Cat. No. CDE-M120a) with a linear range of 0.2-6 ng/mL (QC tested), and batch differences EC50<0.0001 μg/mL.
針對藥物開發各應用場景開發
Fig.3 Immobilized Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 1 μg/mL (100 μL/well) on streptavidin precoated (0.5 μg/well) plate, can bind Monoclonal Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) (Cat. No. CDE-M120a) with a linear range of 0.2-6 ng/mL.
Fig.4 Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) captured on Biotin CAP - Series S sensor Chip can bind Anti-Human CD3 Antibody, Mouse IgG2a (Clone: OKT3) with an affinity constant of 22.5 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) .
Fig.5 Immobilized Human BCMA, His Tag (Cat. No. BCA-H522y) at 2 μg/mL, add increasing concentrations of Bispecific T cell Engager (CD3 X BCMA) in 10% human serum and then add Biotinylated Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His,Avitag&Tag Free (Cat. No. CDD-H82W6) at 0.2 μg/mL. Detection was performed using HRP-conjugated streptavidin with sensitivity of 15 ng/mL.
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參考文獻：
Emily Han-Chung Hsiue et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science, 2021, doi: 10.1126/science.abc8697.