首先，為了證實大多數發揮中和作用的抗體是靶向Spike RBD區域的抗體，這項研究選用了在不同時間點（癥狀消失后15-121天）采集的來自17個康復病人的35份血清樣本，用偶聯RBD的磁珠捕獲并去除血清中的RBD抗體。研究人員用磁珠法處理前后的血清與Spike RBD或整個Spike胞外域蛋白分別進行ELISA結合實驗，從而比較RBD抗體剝離前后的血清中和能力。實驗表明，用磁珠法捕獲RBD抗體可以有效去除血清中的RBD抗體，同時保留靶向其它結合位點的抗體。如圖1所示，在分離血清中的RBD抗體后，血清與RBD的結合急劇減少，幾乎完全消失；但與Spike的結合只減少了一些，說明血清中還有其它抗體存在。這項實驗也向我們展示了RBD抗體在血清中總抗占有相當的比例。

圖1. 磁珠法分離RBD抗體前后（pre vs. post）康復血清對RBD（上）和spike（下）的結合活性。

同時，研究組測試了這35份血清樣本在RBD抗體剝離前后對Spike (D614G) 假病毒的中和活性。結果顯示，在約94%的樣本中，血清的大部分中和活性是由RBD抗體提供的；在超1/3的樣本中，RBD抗體提供了>90%的血清中和活性（圖2）。通過磁珠和假病毒的方法，RBD抗體的關鍵作用得到驗證，因此接下來的研究也聚焦在RBD上的突變。

圖2. 磁珠法分離RBD抗體前后（pre vs. post）35份康復血清對Spike(D614G)假病毒的中和抗體滴度（NT50）。實心球代表抗體分離前；空心球代表抗體分離后；標黃代表在后續實驗中用于繪制突變逃逸圖譜的血清樣本。右側的百分比數字代表血清總抗中由RBD抗體提供的中和活性。

為全面分析所有可能導致抗體中和作用下降的RBD突變，該研究組通過deep-mutational scanning繪制出了RBD的突變圖譜。該方法是通過建立一個龐大的酵母展示庫，在每個酵母菌表面展示一種不同的RBD突變蛋白。整個文庫包括了幾乎所有可能發生的RBD單點突變。這項實驗使用了康復后15-61天內收集的11份來自不同個體的血清樣本。經D614G假病毒體系驗證，這些選取的血清樣本對RBD都有一定中和作用，其中RBD抗體為總抗提供的中和活性約為63-99%。實驗將酵母展示庫和康復血清一起孵育反應，然后利用熒光激活流式細胞術（FACS）分選并擴增對中和抗體作用呈現顯著逃逸的RBD突變；并用deep sequencing技術測定某個特定RBD突變在新冠基因組中出現的頻率。

研究組將每個RBD突變對血清中和作用的影響定義為該突變的“逃逸系數（escape fraction）”，這個系數越高，逃逸現象越明顯；由此繪制出的“逃逸圖譜（escape maps）”呈現出不同RBD突變的逃逸系數分布情況。研究組將逃逸系數高的RBD突變進行了分析和歸類，發現它們可以被主要劃分為三段突出的RBD結合位點（圖3）：1. Receptor-binding motif（RBM）上的一段receptor-binding ridge；2. 443-450 loop；3. core RBD epitope。RBM上的突變包括E484及發生在E484附近的L455，F456，G485，F486，F490等。據報道，有很多中和活性強的中和抗體靶向443-450這一區間，包括Regeneron雞尾酒療法中的兩種抗體。Core RBD位于距RBM稍遠的位置，靶向這一區域的抗體普遍活性不強，和SARS存在交叉。

圖3. 重要RBD突變位點區間劃分

為探究康復者如果二次暴露在突變病毒的風險下，免疫防線將受到怎樣的影響，研究組對血清抗體活性隨時間的變化做了進一步實驗。他們在稍晚的時間點（康復后76-121天）再次采集了以上11個康復病人的血清，重復實驗并繪制了逃逸圖譜。結果顯示，在超半數樣本中，血清和突變RBD的結合活性無明顯變化，說明血清抗體的特異性保持不變；但在少數樣本中，血清隨著時間過去變得更加廣譜，能夠結合更多突變RBD；在一例樣本中，F456和E484突變對血清活性的影響在初期不明顯，但在后期顯現出來。因為樣本量較少，無法得出明確結論，但可以看出病毒突變對中和抗體免疫防線的弱化作用隨個體和時間不同而變化；且有些血清型對突變有更強的抵抗力。

在大多數情況下，導致抗體結合降低的RBD突變也會降低抗體中和活性，這一點通過spike假病毒中和實驗得到了驗證。使中和作用產生最顯著下降的突變是E484（10-60倍），G446（30倍），G485（3-5倍）等（圖4）。在某些樣本中，血清中和抗體對E484K/E484Q/E484P的中和活性下降可以達到35-60倍；而10倍左右的下降即相當于去除所有血清中RBD抗體的活性損失。

圖4. 假病毒中和實驗驗證不同血清型對不同spike突變的中和作用

圖5. 實驗篩選出的RBD免疫逃逸位點在真實世界中的突變頻率