2017年可謂是CAR-T細胞療法元年，Novartis的Kymriah和Kite（Gilead）的Yescarta兩個細胞治療藥物相繼在2017下半年被FDA批準，將這一療法實現產業化，給全球的癌癥患者帶來了希望。CAR-T藥物的異軍突起也得到了資本市場及傳統藥企的廣泛關注，自2012年以來涉及CAR-T藥物的資本并購總額超過數百億美金，同時全球超過300多項臨床正在進行。
基于CAR-T藥物廣闊的市場前景，遠在大洋彼岸的中國也正在尋求以CAR-T療法為代表的細胞免疫治療產業化突破。2017年12月22日，CFDA發布《細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行)》，為我國細胞治療產品作為藥品屬性的規范化產業化生產拉開序幕。截止目前，短短兩個月內，在CFDA進行臨床試驗申請的CAR-T藥物即超過13個，同時中國在CAR-T領域的探索性臨床研究項目已超過130項，占全球免疫治療細胞治療臨床研究的1/3，僅次于美國。
▲國內CAR-T藥物臨床試驗申請概況▲
雖然近幾年來，CAR-T藥物在安全性和有效性上取得了極大的突破，得以推向市場造?；颊?，但是居高不下的藥品價格（Kymriah:47.5萬美元，Yescarta:37.3萬美元）仍然讓大部分患者望而卻步。CAR-T藥物生產涉及環節多、生產周期長以及安全性要求高是其售價居高不下的主要原因。而CAR-T藥物由于其轉化醫學的鮮明特點，其產業化道路才剛剛起步，充滿無限的挑戰，CAR-T藥物的研發人員無不感嘆CAR-T藥物生產技術將是其真正走向產業化最關鍵的因素。
同時由于CAR-T藥物工業化道路才剛剛起步，相關工藝與其它產品相比更為神秘。為了更好的促進CAR-T藥物的工業化生產，本文將公布的CAR-T藥物生產工藝進行總結，可以看到的是探索中前進的CAR-T藥物生產技術將逐步實現生產流程標準化和規范化，更多安全有效的產品將脫穎而出。
小編插播一句：文末有福利哦~
探索中前進的CAR-T藥物生產技術
CAR-T療法是一種基于整合了CAR基因的自體或異體T細胞療法，其整個生產工藝流程包括采血、分離、激活、轉染、擴增、制劑、放行、運輸和給藥等一系列過程。
▲自體CAR-T藥物生產流程▲
這些生產環節分布于不同機構與組織，通常采血在醫院進行，隨后采取的外周血發送至生產基地進行核心的CAR-T藥物生產，生產放行后的CAR-T藥物再進一步通過冷鏈運輸返回至醫院供病人注射。對于更常見的自體T細胞療法，加上質量檢測整個生產工藝流程通常為30天左右，這對于處于晚期的病人來說這樣的周期長度仍然偏長。各個研發單位基于自身工藝的區別，其生產周期也長短不一，不過生產周期隨著技術的技術的進步正在不斷縮短。
Kite的工藝更為簡便，其生產周期也最短，僅為10天左右。Novartis的生產周期更為復雜一些，其生產周期更長一些達到了29天，雖然Novartis后期進行過一些優化，但仍然有22天。但Novartis生產工藝目前被認為是比較標準的CAR-T藥物生產工藝，其生產工藝的穩定性也得到了充分的驗證，在Novartis關鍵性的臨床試驗B2202中的78例病例中，只有6例病人因為生產原因（4例因為T細胞未能成功生長，1例因為藥物劑量低于質量標準，1例因為殘留磁珠高于質量標準）未能進行藥物注射。Juno雖然沒有公布其精確生產周期，但是也透露在14-18天左右，同時基于其前期的臨床試驗結果不太理想，對其生產工藝進行了充分的優化，率先使用了CD4和CD8等比例的T細胞源進行生產，極大地保證了藥物的有效性，Juno透露其第三代和第四代技術目標將縮短至3-6天。
▲CAR-T藥物研發**企業工藝流程▲
從目前來看，整個CAR-T藥物的生產技術對于儀器的依懶性還是比較高的，也就是選擇怎樣的生產儀器即決定了怎樣的生產工藝。但對于CAR-T藥物的生產工藝兩項基本原則是：封閉的及可重復的。近年來，各個設備提供商們也極大地推動了自身設備的研發，為每個CAR-T單元生產環節提供解決多種方案。同時還提供了整理解決方案的設備，例如CliniMACS一款儀器可以實現從細胞篩選到最終制劑制備的整個T細胞生產工藝，當然其售價及后期使用價格也更為高一些。但無論基于怎樣的設備考量，每個生產環節的目的仍然是一樣的。
▲CAR-T藥物單元操作流程▲
首先，T細胞療法從體內全血中獲得患者的白細胞。通常在采集過程中會加入抗凝劑，使用密度梯度介質連續或間斷離心法分離血液成分。采集過程中，仍然會有少量紅細胞和血小板會殘留在收集的白細胞中，紅細胞會影響最終T細胞藥物的效率，血小板會引起細胞聚團，而抗凝劑有可能會改變細胞的生化特性，因此在采集后的白細胞首先要進行淘洗。Ficoll梯度離心是最常用的分離方式，但是其由于是非封閉的系統而逐漸被淘汰。自動淘洗裝置COBE 2991 Cell Processor，Haemonetics CellSaver ，Biosafe Sepax II以及CaridianBCT Elutra單細胞采集器等儀器使用越來越常見。
淘洗后的T細胞根據工藝的要求會進一步進行富集，有的需要CD4和CD8等比例，有的需要采集CD56或者CD3陽性的T細胞，目前有通過抗體磁珠、細胞大小或者流式細胞儀等多種特異性的細胞富集方式。
在體內，T細胞主要依靠樹突狀細胞（DC）等抗原呈遞細胞的分化刺激T細胞增殖。通過如CD28、4-1BB，OX40共刺激分子，T細胞被T細胞受體（TCR）與位于DC細胞表面的主要組織相容性復合體相互作用所激活。在體外培養過程中，為了避免與DC同培養的過程的繁瑣過程，有幾種方法模仿天然T細胞激活過程已經開發并實施。最早方法是抗CD3抗體和IL-2的聯合使用，或許又有方法將抗CD3抗體、抗CD8抗體以及IL2三者進行聯用激活，接著Invitrogen和Miltenyi分別開發的CD3/CD28抗體磁珠極大地提高了激活效率，目前以抗體磁珠為代表的激活方式占到了60%以上。
T細胞進行激活以后，就需要將其改造成注射到體內的形式，這一步將是整個CAR-T藥物生產工藝的核心。目前最常用方式是通過病毒轉染方式進行T細胞改造，這其中又以逆轉錄病毒和腺相關病毒的轉染方式更為普遍，兩者占到了所有轉染方式的90%左右。逆轉錄病毒技術更為傳統，其安全性高、生產成本也更低一些。但腺相關病毒基于其轉染效率高的特點，使用比例正在不斷增加。同時由于病毒載體的生產和質量控制也極為復雜，目前大多數細胞治療的病毒載體都是外包生產?；诎踩苑矫娴目紤]，轉座子電轉等一些轉染方式也逐漸得到關注，但是其轉染效率仍然有比較大的限制。另一方面，ZFN、TALEN和CRISPR等一些基因敲除的改造方式也逐步運用到異體T細胞治療中。
▲基因轉染方式比較▲
改造后的T細胞，下一步就需要培養到足夠的數量以輸送到病人體內，這是整個T細胞藥物生產的另一個關鍵步驟，目前最常用的三種方式為靜置的方瓶培養、透氣式的培養袋培養以及擺動的反應器培養，這些培養根據最終需要的T細胞數量可以靈活選用合適的培養方式。目前大多數T細胞藥物劑量為10e8-10e9個，因此傳統靜置越來越難以滿足培養要求，以Xuri為例的擺動的反應器培養方式因為更高細胞密度和更短的培養時間，逐步應用到T細胞的生產中，占有比例達到40%以上。
近來，《Current Opinion in Biotechnology》上的一篇文章，通過對2002至2017年9月以來所有公布的CAR-T藥物生產工藝，綜合來看，約有19%的采用抗體IL2聯合激活+病毒轉染+方瓶擴增的工藝，約有18%的采用抗體IL2聯合激活+病毒轉染+培養袋擴增的工藝，還有43%的采用抗體磁珠激活+病毒轉染+方瓶擺動反應器擴增的工藝，這也體現了在不斷探索中前進的CAR-T工藝。
▲CAR-T藥物關鍵生產工藝概況▲
然而對于整個CAR-T生產工藝卻沒有結束，還需要有一系列的質量檢測。以CAR-T CD19為例，目前對最終產品外觀、安全性、純度、雜質、鑒定、數量及活性方面進行一系列的控制，藥物的T活性要高于70; 21CFR610.12中14天的無菌檢測法至少保證第七天仍是陰性；內毒素要求為5 EU /Kg/h；CD19的B細胞含量應低于2%。
▲CAR-T藥物質量控制▲
自體T細胞療法的每個產品都是獨立批次，為保持CAR-T批間質量一致，對CAR-T生產的每一步實施質量控制十分必要。其中，CAR表達水平作為CAR-T質量控制的重要參數之一，通常通過流式細胞術檢測CAR陽性T細胞占總T細胞的比例來評估，即CAR陽性表達率，目前要求為不低于15%。同時必須強調的是所有最終CAR-T藥物的劑量都是陽性T細胞來計數的，所以CAR-T細胞的陽性檢測十分關鍵，筆者在此分享幾個案例。
案例一、Anti-BCMA CAR表達陽性率檢測
案例來源：深圳普瑞金生物藥業公司
檢測方法：流式細胞術
檢測儀器：BD FACSCalibur流式細胞分析儀
樣本信息：轉染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴細胞
主要試劑：
生物素標記的hBCMA蛋白（Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17Protein，Fc Tag，Avi Tag（AvitagTM），ACROBiosystems，Cat.No.BC7-H82F0）；
PE標記的鏈霉親和素（PEStreptavidin，Biolegend，Cat.No.405204）；
簡要流程：
1. 將anti-BCMA CAR基因通過慢病毒質粒轉染，整合到來自患者的自體T細胞基因中；
2. 利用anti-BCMA CAR特異性結合BCMA蛋白的特性，將生物素標記的hBCMA蛋白（ACROBiosystems，Cat.No.BC7-H82F0）標記到anti-BCMACAR-T細胞表面；
3. 利用生物素特異性結合親和素的特性，將PE標記的鏈霉親和素（Biolegend，Cat.No.405204) 作為熒光二抗，標記到anti-BCMACAR-T細胞表面；
4. 用BD FACSCalibur流式細胞分析儀進行檢測分析。
檢測結果：
結果顯示1號患者anti-BCMA-CAR T細胞陽性率在52.72%，2號患者anti-BCMA-CART細胞陽性率在73.49%。
Human T cells were transfected with anti-BCMACAR and cultured for 3 days. Three days post-transfection, 1x10 6 cellswere first incubated with 50ul biotinylated human BCMA protein(Cat.No. BC7-H82F0, 8ug/ml ), washed and then stained with PE Streptavidinand analyzed by flow cytometry. (Data are kindly provided by PREGENE Biopharma)
案例二、Anti-CD19 CAR表達陽性率檢測
案例來源：ACRO公司應用開發團隊自主研發
檢測方法：流式細胞術
檢測儀器：NovoCyteTM Flow Cytometer,ACEA Biosciences
樣本信息：R1013-C6細胞（過表達Anti-CD19[FMC63]scFv & RFP的Expi 293細胞）
主要試劑：
生物素標記的hCD19蛋白（Biotinylated Human CD19，Fc Tag,ultra sensitivity （primary amine labeling），ACROBiosystems，Cat.No.CD9-H8259）；
FITC標記的鏈霉親和素（FITC Streptavidin，Biolegend，Cat.No.405201）；
簡要流程：
1. 將Anti-CD19[FMC63] scFv& RFP基因通過質粒轉染，整合到Expi 293細胞基因中，命名為R1013-C6細胞；
2. 利用anti-CD19[FMC63]scFv特異性結合CD19蛋白的特性，將生物素標記的hCD19蛋白（ACROBiosystems，Cat.No.CD9-H8259）標記到R1013-C6細胞表面；
3. 利用生物素特異性結合親和素的特性，將FITC標記的鏈霉親和素（FITC Streptavidin，Biolegend，Cat.No.405201)作為熒光二抗，標記到R1013-C6細胞表面；
4. 用NovoCyteTMFlow Cytometer流式細胞分析儀進行檢測分析。
檢測結果：
結果顯示生物素標記的CD19蛋白能夠與 R1013-C6細胞膜表面的anti-CD19 [FMC63]
293 cells were transfected with FCM63-scFv andRFP tag. 2x105 of the cells were first incubated with A.Biotinylated protein control. B. Recombinant biotinylated human CD19 (Cat. No.CD9-H8259, 10ug/ml). C. Recombinant biotinylated human CD19 (Cat. No.CD9-H8259, 10ug/ml) and FMC63 (Mouse anti-CD19 antibody), followed by FITCStreptavidin, and then analyzed using NovoCyteTM Flow Cytometer. RFP was usedto evaluate CAR(FMC63-scFv) expression and FITC was used to evaluate thebinding activity of recombinantbiotinylated human CD19 (Cat. No. CD9-H8259).
ACROBiosystems
ACROBiosystems作為專注于醫藥研發領域的蛋白供應商，利用專業的蛋白研發平臺和生物素標記平臺，開發了一系列CAR-T靶點蛋白，助力CAR-T療法的開發，其中生物素預先標記的蛋白在Biopanning篩選scFv，以及流式細胞技術檢測CAR表達和篩選CAR表達的細胞中獨具優勢。目前產品已覆蓋BCMA，CD19，ROR1，EGFRVIII等20余個CAR-T熱門靶點。如果您有其他相關案例分享或者對以下某個案例細節感興趣，請聯系cart@acrobiosystems.com。
ACRO CAR-T靶點蛋白產品列表
| BCMA | CAIX | CD138 | CD19 | CD20 |
| CD22 | CD30 | CD33 | CD38 | HGFR |
| EGFR | EGFRVIII | EpCAM | FOLR1 | GPC3 |
| HER2 | IL13Rα2 | MSLN | MUC1 | ROR1 |
* ACRO CAR陽性表達率檢測方案合作開發項目進行中，CAR-T靶點蛋白免費領，更有禮品等您來拿，點擊“CAR陽性表達率檢測方案”查看詳情；
展望
CAR-T藥物雖然歷經幾十年的發展，但是工業化的道路近幾年才慢慢走通，底子相對還很薄。同時如上所述，基于其轉化醫學的鮮明特點，其在工業化生產方面仍然還存在不少難點和痛點，挑戰重重。但是無論怎樣，治病救人，安全質量仍然需要考慮到第一位，必須逐步實現生產的流程標準化和規范化，嚴格做好CAR-T藥物的質量控制。
參考文獻
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2. Piscopo N J, Mueller K P, Das A, et al. Bioengineering solutions for manufacturing challenges in CAR T cells[J]. Biotechnology journal, 2017.
3. Siegler S E. Autologous CAR-T Cell Manufacturing: Current Standing and Future Directions. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2017.